化学发光法检测传染病专家讲座

化学发光法快速检测传染病

更灵敏、更特异、更准确化学发光法检测传染病专家讲座第1页放免酶联免疫化学发光荧光免疫60年代70年代80年代90年代免疫标识技术发展国产进口酶促化学发光直接化学发光化学发光法检测传染病专家讲座第2页

化学发光技术优势与应用前景

.敏感度高，(10-21mol/L)超出酶免，荧光免疫等方法.精密度，准确度超出放免，酶免，荧光免疫等方法.试剂稳定，无放射性，污染或生物毒性；.测定耗时短，方便快速提供结果汇报；.测定项目齐全；已发展成全自动测定系统。化学发光法检测传染病专家讲座第3页包被微粒子包被磁珠包被微孔包被试管包被技术发展---磁微粒子化学发光法检测传染病专家讲座第4页包被磁微粒标识异鲁米诺Eg:双抗夹心法分析模式

磁微粒子上包被抗体与待检测抗原及异鲁米诺标识抗体结合提升检测功效灵敏度增加检测线性范围比吖啶酯更稳定延长试剂效期化学发光法检测传染病专家讲座第5页**********YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY*YYYYYYYY微粒包被液相反应化学发光法检测传染病专家讲座第6页磁微粒、直接化学发光反应反应充分速度更加快酶标板，板式磁微粒，纳米级，均相化学发光法检测传染病专家讲座第7页CLIA板式载量YYYYYYYYY磁微粒子直接化学法Ag/Ab酶标板发光板Ag/Ab微粒子化学发光法抗体载量优势化学发光法检测传染病专家讲座第8页分配样品,磁颗粒和试剂孵育使反应物结合在磁场中清洗去除未结合物质加入激发液产生信号信号检测微粒子化学发光原理化学发光法检测传染病专家讲座第9页磁性微粒子及其分离技术磁性微粒子技术优点：快速分离结合相与游离相提升与Ag或Ab包被亲和力提升接触表面积/反应容量百分比，实现微量分析不需要抗体分离步骤，杜绝干扰与交叉反应允许共价耦合反应，所以能够检测大/小分子各种物质成份能应用各种分析设计与反应模式，扩大应用范围如：夹心法，竟争法，抗体检测法等利于检测自动化与微量分析化学发光法检测传染病专家讲座第10页磁微粒子直接化学发光是最新一代免疫检测新技术含有液相、快速、灵敏、准确特点经过多中心临床评定，基本上验证了LICA在乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、肿瘤标志物、甲状腺功效等项目标临床可用性多家临床试验显示产品质量不亚于进口雅培、罗氏和西门子等厂家产品媲美。化学发光法检测传染病专家讲座第11页1）磁性微粒子技术：便于分离，反应均匀，提升灵敏度2）泉涌内外壁清洗技术：最小交叉污染率3）试剂盒盖设计：降低人工操作误差和交叉污染，防止试剂挥发影响结果准确性4）试剂冷藏系统：确保在仪器操作过程中试剂能够一直保持稳定5）磁性分离技术：确保了清洗效率，对于灵敏度要求极高标识免疫分析是十分关键技术化学发光法检测传染病专家讲座第12页雅培

免疫项目甲状腺功效甲状腺素三碘甲状腺原氨酸游离甲状腺素游离三碘甲状腺原氨酸促甲状腺素性腺激素人绒毛膜促性腺激素催乳素雌二醇卵泡刺激素黄体生成素孕酮睾酮肿瘤标志物甲胎蛋白癌胚抗原前列腺特异性抗原游离前列腺特异性抗原糖类抗原125糖类抗原15-3糖类抗原19-9β2微球蛋白铁蛋白神经元特异性烯醇化酶人钙结合蛋白肿瘤相关抗原72-4鳞状上皮癌相关抗原细胞角蛋白CYFRA21-1心血管及心肌标志物N末端脑钠肽肌钙蛋白Ⅰ肌酸激酶同工酶C反应蛋白心肌脂肪酸结合蛋白脂蛋白相关磷脂酶A2髓过氧化物酶肌红蛋白肝纤维化四项透明质酸Ⅲ型前胶原N端肽Ⅳ型胶原蛋白层粘连带白传染病乙型肝炎病毒前S1抗原乙型肝炎病毒e抗体乙型肝炎病毒e抗原乙型肝炎病毒关键抗体乙型肝炎病毒表面抗体乙型肝炎病毒表面抗原丙型肝炎抗体（HCV）梅毒抗体（TP）人类免疫缺点病毒抗体糖代谢类胰岛素C-肽化学发光法检测传染病专家讲座第13页全自动、管式、直接化学发光法

---------------特异性强、性能稳定

超长时间无人值守（1）试剂区15个试剂位，（2）样本区12╳12=144个样本位（3）码垛区一次性装载720个反应杯测试中可随时添加，随时替换化学发光法检测传染病专家讲座第14页真正急诊功效，急诊样本，随到随测。测试速度高达220测试/小时原试管上样，无需倒管。全封闭反应舱，有效降低外界环境干扰和污染全汉字软件，图标式界面，操作更简便综合测试成本低

化学发光法检测传染病专家讲座第15页

管式、微粒子包被技术，反应速度更加快，结果更准确。ELISA法检测乙肝表面抗原、梅毒、艾滋、丙肝按照年《药典》要求反应时间最少要2小时30分钟；而全自动微粒子化学发光试剂则不到30分钟即可完成。稳定性更加好特异性更加好大部分国际一流厂家也都采取直接发光法：罗氏西门子雅培…….化学发光法检测传染病专家讲座第16页传染病试剂传统酶免法和微粒子化学发光法对比方法学项目传统酶免法微粒子发光法分析敏感度特异性精密度分析敏感度特异性精密度HBsAgadr0.1IU/mLadw0.1IU/mLay0.2IU/mL(-/-)20/20(+/+)3/313.21%adr0.1IU/mLadw0.1IU/mLay0.2IU/mL(-/-)20/20(+/+)3/38.03%HBsAb10mIU/mL(-/-)20/2012.05%10mIU/mL(-/-)20/207.45%HBeAg1#

≥1:642#

≥1:1283#

≥1:32(-/-)15/15(+/+)9/1012.04%1#

≥1:642#

≥1:1283#

≥1:32(-/-)15/15(+/+)10/108.03%HBeAb1#

≥1:322#

≥1:643#

≥1:64(-/-)15/15(+/+)9/1012.31%1#

≥1:322#

≥1:643#

≥1:64(-/-)15/15(+/+)10/108.20%HBcAb1#

≥1:1282#

≥1:1283#

≥1:256(-/-)15/15(+/+)14/1514.03%1#

≥1:1282#

≥1:1283#

≥1:256(-/-)15/15(+/+)15/1510.34%HCVL1、L2阳性，L3阴性，L4阴性(-/-)29/30(+/+)29/3010.05%L1、L2阳性L3阳性，L4阴性(-/-)30/30(+/+)30/307%HIVS1,S2阴性,S3,S4,S5,S6阳性(-/-)18/20(+/+)20/2014.34%S1阴性,S2,S3,S4,S5,S6阳性(-/-)20/20(+/+)20/2010%TPL1、L2阳性，L3阴性，L4阴性(-/-)20/20(+/+)10/1011.26%L1、L2阳性L3阳性，L4阴性(-/-)20/20(+/+)10/107.98%化学发光法检测传染病专家讲座第17页

参比试剂：雅培I乙肝灵敏度特异性符合率HBsAg97.92%100%99.78%Anti-HBs95.98%97.38%96.69%hiv95.24%100%99.59%Anti-HBe90.77%97.21%95.36%Anti-HBc91.54%98.9%94.48%试剂性能多中心临床评定（乙肝）化学发光法检测传染病专家讲座第18页免疫测定试剂关键点作为免疫反应，抗原抗体选择是整个免疫分析特异性和总体表现关键怎样选择好一个抗体(单克隆或多克隆)去检测一个被检物质，而不与非常相同结构其它代谢产物有交叉反应,或着是一些没有临床意义分解产物等，这是分析设计重点中之重点。批内、批间分析重现性。化学发光法检测传染病专家讲座第19页AFPHBsAg4.50%1.79%4.91%2.14%HCV12345……MeanSDCV批内86.1186.3688.4087.9086.43……86.271.551.79%批间74.5973.6369.6471.9071.96……71.013.204.50%HBsAg12345……MeanSDCV批内72.5971.2576.5075.0578.03……76.611.642.14%批间0.220.220.230.220.23……0.230.014.91%批内批间微粒子化学发光试剂精密度化学发光法检测传染病专家讲座第20页相关性相关系数线性系数HIV显著相关0.990.98HCV显著相关0.930.99参比试剂：雅培试剂性能多中心临床评定化学发光法检测传染病专家讲座第21页相关性相关系数线性系数HIV显著相关0.970.92HBsAg显著相关0.960.95N=500，参比试剂：雅培I试剂性能多中心临床评定化学发光法检测传染病专家讲座第22页

丙型肝炎抗体诊疗试剂丙肝病毒复杂基因结构：决定了抗体谱差异，从而为丙肝抗体检测敏感度提升带来了困难。化学发光法检测传染病专家讲座第23页丙肝诊疗试剂当前存在问题1、灰区标本迷惑2、阳性标本漏检化学发光法检测传染病专家讲座第24页问题形成技术原因---灰区形成1、重组抗原原因（1）融合蛋白（2）大肠杆菌杂蛋白2、第二抗体非特异反应（1）酶标抗体对固相载体直接吸附酶标二抗对于丙肝抗体是非特异，和各种人IgG均能反应结合。（2）个别标本中IgG浓度过高多聚体混合：E-E、E-Ab、E-Ab-E、E-Ab-E-Ab，既引发本底背景，又阻遏抗原抗体反应化学发光法检测传染病专家讲座第25页问题形成技术原因---阳性标本漏检1、关于灵敏度两个概念（1）分析灵敏度决定原因：

a.单个抗原决定族抗原性强弱。

b.试剂盒信号放大能力（2）流行病学敏感度决定原因：

a.抗原片段种类是否齐全。

b.是否含构像抗原。

c.分析灵敏度高低。化学发光法检测传染病专家讲座第26页CE1E2/NS1NS2NS3NS4aNS4bNS5aNS5b丙型肝炎病毒基因结构ELISA-1stRIBA-1stELISA-2stRIBA-2stELISA-3stRIBA-3stC22-3C22-3NS5NS5C100C1005-1-1C33CC100C33CC1005-1-1C33CC33CC100C1005-1-12、抗原片段种类不全化学发光法检测传染病专家讲座第27页3、包涵体抗原，抗原性弱4、缺乏构像表位5、原核表示分子量小，抗原表位有限6、抗原非糖基化，稳定性差7、信号放大能力有限8、固相载体形成空间位阻问题形成技术原因---阳性标本漏检化学发光法检测传染病专家讲座第28页新型丙肝化学发光试剂关键技术1、包被和标识实现双特异，以降低假阳性率，并提升分析敏感度。2、经过整体系统优化，深入扩大阴阳反差，使结果判读泾渭分明。化学发光法检测传染病专家讲座第29页新型丙肝化学发光试剂技术策略---灰区处理1、酵母真核表示抗原，高效降低灰区标本

eg:E.coli与Pichiapastoris检测国家标准国家标准品表示载体N2N4N24P1P5P21大肠杆菌（原核表示）0.2600.1490.2350.7422.6590.706毕赫酵母（真核表示）0.0600.0140.0171.7362.8331.619化学发光法检测传染病专家讲座第30页AntiHCV重组NS3抗原

NS3HCV病毒最主要抗原经过酵母真核系统成功表示NS3抗原,多重折叠以到达高度免疫活性

高纯度;易于直接标识化学发光法检测传染病专家讲座第31页2、针对Fab端单特异性抗体标识物

普通二抗和单特异抗体对比

国家标准二抗类型P27L3N2N4N18N24L4普通单抗0.5600.1600.2300.1620.0710.2140.065单特异抗体0.8920.3210.0650.0430.0140.1020.009化学发光法检测传染病专家讲座第32页

3、板式固相载体升级为管式磁微粒子包被★包被量更富足★管式液相反应更充分★更有效处理空间位阻效应化学发光法检测传染病专家讲座第33页

4、光信号检测，提升信噪比

信号放大代替靶标放大，降低靶标放大带来非特异性反应，远远大于ELISA信噪比。化学发光法检测传染病专家讲座第34页新型丙肝化学发光试剂---降低漏检率1、在CORE、NS3、NS4、NS5基础上增加了E1区，确保抗原片段齐全2、pichiapastoris表示系统带来以下优势（1）非包涵体而可溶性表示，抗原性强（2）因糖基化而提升稳定性（3）分子量大，抗原表位丰富（4）含有构像抗原表位，而提升检出率3、磁微粒子标识抗原增加抗原抗体反应强度化学发光法检测传染病专家讲座第35页新型丙肝化学发光试剂

检测国家参考品符合率对比方法学阳性符合率阴性符合率最低减出限ELISA30/3029/303/4CLIA30/3030/303/4化学发光法检测传染病专家讲座第36页新型双特异丙肝化学发光诊疗试剂

临床验证汇报方法学真阳性检出率假阳性率酶免试剂146/15019/新型双特异150/1503/化学发光法检测传染病专家讲座第37页丙肝化学发光试剂临床对比试验汇报对照试剂：雅培ISR试验单位：包头市中心医院雅培总计阳性阴性威高阳性404阴性11314总计51318NO。雅培CUTOFF=18000威高CUTOFF=5040RLUs∕coRLUs∕co17200.0415970.317225200.1420720.411318000.117490.347412600.0717230.342514400.0818750.372618000.1018790.373721600.1223130.45985400.0315120.30099000.0516170.321107200.0416020.3181110800.0618390.365125400.0315220.302137200.0416170.32114340201.8939410.7821522644012.582