基因工程制药新版

基因工程制药新版基因工程制药新版第1页血红蛋白基因血红蛋白基因排列次序血红蛋白结构血红蛋白运输氧气功效血红蛋白基因工程流程基因工程制药新版第2页一、工具酶分离纯化（一）基因工程制药所用到工具酶

（二）关于限制酶（三）关于连接酶

基因工程制药新版第3页（一）基因工程制药所用到工具酶限制性内切酶 甲基化酶Klenow聚合酶

T4-DNA聚合酶T4-多核苷酸激酶 碱性磷酸酶核酸酶-S1 核酸酶-Bal31绿豆核酸酶 核糖核酸酶人外切核酸酶 DNA酶-1外切RNA酶-III 外切RNA酶-VIDNA聚合酶1

T4-DNA连接酶末端脱氧核苷酸转移酶 T4-RNA连接酶逆转录酶大肠杆菌-DNA连接酶

基因工程制药新版第4页（二）关于限制酶1、宿主限制现象2、限制酶定义3、限制酶特征4、限制酶作用5、基因工程所用到限制酶6、影响限制酶作用原因

基因工程制药新版第5页1、宿主限制现象

病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在宿主B细胞中生长很差,原因是它DNA受到宿主B限制,这种现象是宿主控制性限制（restriction）与修饰(modification),简称（R/M体系）。细菌R/M体系类似于免疫系统，能区分本身DNA与外来DNA，并能使后者降解掉。基因工程制药新版第6页R/M体系：是由两种酶活性配合完成：一个是修饰甲基转移酶另一个是核酸内切限制酶基因工程制药新版第7页E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，因为其DNA中有EcoB核酸酶特异识别碱基序列，被降解掉。而E.coliBDNA中即使也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列特定碱基，使之甲基化。

※EcoB(大肠杆菌B株)核酸酶不能识别已甲基化序列。基因工程制药新版第8页

R/M体系作用：保护本身DNA不受限制；破坏外源DNA使之快速降解TGAN8TGCTACTN8ACGATGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌体起源序列宿主起源序列基因工程制药新版第9页※限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ一类酶，其功效是防止外源ＤＮＡ干扰或噬菌体感染，是细胞中一个防御机制。※因为R/M现象发觉使得核酸内切酶成为基因工程主要工具酶。基因工程制药新版第10页2、限制酶定义

凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸次序酶称为限制酶。限制酶分为三个类型：（1）Ⅰ型限制酶-----因为其切点不固定，极难形成特异性切割末端。（2）Ⅱ型限制酶-----是位点特异性酶，是基因工程理想工具酶。（3）Ⅲ型限制酶-----对DNA识别与切割点不一样，不产生特异性DNA片段。基因工程制药新版第11页3、限制酶特征

含有专一性识别位点。能够形成固定核苷酸单链末端。比较适合于进行DNA结构分析和进行基因重组。基因工程制药新版第12页4、限制酶作用（1）进行DNA重组。（2）构建新载体。（3）构建基因文库。（4）进行DNA序列分析。（5）制备DNA放射性探针。基因工程制药新版第13页5、基因工程所用到限制酶通常是Ⅱ型限制酶，详细有以下几个。EcoR-I

Hind-III

BamH-IPst-I Sst-I Sal-IAva-I Bcl-I Hind-IIHpa-I Bgl-II Cla-IHae-III Hha-I Hinf-IHpa-II Mbo-I Sma-IXba-I

Xho-I基因工程制药新版第14页6、影响限制酶作用原因（1）DNA纯度（2）DNA甲基化程度（3）DNA结构（4）反应温度----最适温度为37度（5）反应缓冲体系----反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白。它们含有激活酶、稳定酶作用。基因工程制药新版第15页（三）关于连接酶1、定义----凡是能够催化DNA片段5’-末端磷酰基与3’-末端羟基结合成磷酸二酯键酶，称为连接酶。2、作用----主要用于

（1）正常DNA合成。

（2）损伤DNA修复。3、种类

（1）DNA-连接酶----广泛存在于生物细胞之中，主要取自于大肠杆菌E.coli。

（2）T4-DNA连接酶----来自于经过T4-噬菌体感染大肠杆菌E.coli。（3T4-RNA连接酶----催化单链DNA或RNA5‘磷酸与另一单链DNA或RNA3’羟基之间形成共价连接。基因工程制药新版第16页二、基因工程载体分离纯化（一）定义（二）基因工程载体必备条件（三）基因工程载体种类

基因工程制药新版第17页（一）定义

能够将目标基因携带进宿主细胞、并可使得目标基因能够在宿主体内进行自主性复制遗传因子，称为基因工程载体。

基因工程制药新版第18页（二）基因工程载体必备条件

（1）含有有效运载能力。

（2）载体本身能够独立复制，而且在宿主体内进行自主性复制。

（3）载体在携带目标基因之后，还能够在宿主体内进行自主性复制。

（4）在宿主体内，能够控制外源基因表示活动。

（5）能够携带大小不一样外源性目标基因。

（6）判定方便、装卸技术简单。

（7）轻易控制、安全可靠。

基因工程制药新版第19页

（8）应含有灵活克隆位点、而且有方便筛选标识。

（9）应含有很强开启子。

（10）应含有阻遏子，使开启子受到控制，因为外源基因高效表示会抑制宿主细胞生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。

（11）应含有很强终止子，方便重点克隆外源基因区段，而不转录其它无关基因。

（12）所产生mRNA必须含有翻译起始信号，即含有起始密码AUG和SD序列，方便转录之后能够顺利于进行翻译。基因工程制药新版第20页（三）基因工程载体种类1、细菌质粒2、真核基因病毒DNA3、λ噬菌体DNA4、单链DNA噬菌体M13载体5、人工质粒载体----科斯质粒6、酵母人工染色体7、其它载体

基因工程制药新版第21页1、细菌质粒（1）质粒定义（2）质粒特征（3）质粒分类（4）质粒载体具备条件（5）常见细菌质粒

基因工程制药新版第22页（1）质粒定义

存在于天然细菌体内一个独立于细菌染色体之外双链环状DNA，含有独立复制能力，常带有细菌抗药基因。也存在于一些真核细胞（酵母2μ环状质粒）质粒载体(plasmid)基因工程制药新版第23页（2）质粒特征

独立于细菌染色体之外环状DNA或RNA。其遗传特征属于非染色体控制。能够进行自我复制。轻易在宿主体内进行转移和迁移。可编码宿主染色体所不含有基因。能够赋予宿主额外遗传特征：

A、编码产生抗生素酶抗性基因，

B、编码产生糖酵解酶系基因，

C、编码产生抗重金属酶抗性基因。基因工程制药新版第24页质粒复制类型

◆严谨型（strigentplasmid)：复制与宿主染色体同时受宿主染色体复制限制，在宿主细胞中拷贝数低约１～３份拷贝。◆松弛型（relaxedplasmid):

复制不受宿主染色体复制限制可独立复制，在宿主细胞中拷贝数高，宿主细胞中质粒有10-200拷贝。基因工程常见载体。基因工程制药新版第25页质粒DNA构型

三种不一样构型：当其两条核苷酸链均保持着完整环形结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这么DNA通常展现超螺旋SC构型；假如两条多核苷酸链中只有一条保持着完整环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)；若质粒DNA双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。基因工程制药新版第26页单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA（SC型）开环DNA（oc型）线性DNA（L型）环形双链质粒DNA分子含有三种不一样构型基因工程制药新版第27页（3）质粒分类F质粒----可使宿主A个别基因伴随F质粒一起转移到不存在该质粒另一宿主B体内。

R质粒----可编码宿主A一个或者数种抗生素抗性基因，并能够将它们带到不存在该质粒另一宿主B体内，使得宿主B也取得一样抗性。

Col质粒----能编码大肠杆菌毒素基因，经过表示之后产生大肠杆菌毒素能够使得不带Col质粒其它菌株死亡。基因工程制药新版第28页（4）质粒载体具备条件

质粒载体，也称质粒克隆载体，是指用于实现基因工程操作质粒。必须具备以下条件：（1）其分子结构中必须含有多个单一限制酶切割位点。（2）构建重组质粒之后必须含有转化功效。（3）分子量较小，易于操作。（4）宿主范围较为单一、无感染性。基因工程制药新版第29页（5）常见细菌质粒pBR322 pBH10 pBH20pTR262 pAT153 pXf3Pmk16 pGEM-3Z pUC19[A]、pBR322质粒[B]、pUC19质粒[C]、pGEM-3Z质粒基因工程制药新版第30页[A]、

pBR322质粒①4363bp②含一个复制点含一个抗氨卞青霉素基因(ampR)④

一个抗四环素基因(tetR)⑤ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶酶切位点，供外源基因插入当外源基因插入抗药基因内，抗药基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).基因工程制药新版第31页pBR322:人工构建主要质粒优点：含有较小分子量．含有两种抗生素抗性基因，作为筛选标识．含有高拷贝数．是松弛型质粒．基因工程制药新版第32页[B]、pUC系列质粒

由pBR322和M13噬菌体构建而成双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampR和位于lacZ+基因中靠近5’端多克隆位点(MCS)和起源于pBR322质粒复制起始点（3）大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)开启子及其编码该基因氨基端α-肽链DNA序列,此结构特称为lacZ+基因，便于蓝白筛选基因工程制药新版第33页pUC质粒优点：１．含有更小分子，更高拷数２．适于组织化学检测重组体．

基因工程制药新版第34页[C]、pGEM-3Z质粒

含一个ampR基因和一个lacZ’编码基因;

有多克隆位点（MCS）;

正选择颜色标识lacZ’;

有两个来自噬菌体强开启子PT7和PSP6,用于外源基因高效表示

注意：T7和SP6开启子特异性地由噬菌体DNA编码RNA聚合酶所识别，所以对应受体菌必须表示噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3ZPSP6基因工程制药新版第35页2、真核基因病毒DNA（1）病毒载体优点（2）已经研究真核基因病毒DNA基因工程制药新版第36页（1）病毒载体优点[A]、含有很高拷贝数量。[B]、有强大开启子。[C]、可确保目标基因高效表示。

基因工程制药新版第37页（2）已经研究真核基因病毒DNA[A]、SV40病毒DNA[B]、牛乳头瘤病毒[C]、RNA病毒[D]、昆虫杆状病毒[E]、人痘病毒DNA[F]、猴空泡病毒DNA[G]、人腺病毒DNA

[H]、人牛痘病毒DNA[I]、逆转录病毒载体基因工程制药新版第38页[A]、SV40病毒DNA（A1）、SV40病毒DNA特征（A2）、SV40病毒DNA基因组（A3）、SV40病毒DNA载体构建（A4）、SV40病毒DNA载体使用方法基因工程制药新版第39页（A1）、SV40病毒DNA特征为环状双螺旋结构。其宿主为动物细胞。

SV40病毒有二种表示方式：

（1）游离表示方式，SV40DNA+外源性DNA，形成重组DNA，进入宿主体内，以重组DNA方式表示。

（2）结合表示方式，重组DNA整合到宿主染色体DNA之中，与染色体基因一起表示。基因工程制药新版第40页（A2）、SV40病毒DNA基因组基因工程制药新版第41页（A3）、SV40病毒DNA载体构建基因工程制药新版第42页（A4）、SV40病毒DNA载体使用方法基因工程制药新版第43页[G]、腺病毒（G1）、腺病毒DNA载体（G2）、腺病毒DNA载体特点基因工程制药新版第44页3、λ噬菌体DNA（1）λ噬菌体DNA特征（2）λ噬菌体DNA改造（3）λ噬菌体DNA体外包装（4）λ噬菌体载体构建（5）λ噬菌体载体使用（6）λ噬菌体载体优点基因工程制药新版第45页（1）λ噬菌体DNA特征λ噬菌体DNA为双链DNA病毒，宿主是大肠杆菌。已发觉λ噬菌体DNA可编码61个基因。[A]、λ噬菌体DNA在宿主体内生活方式[B]、λ噬菌体DNA结构基因工程制药新版第46页[A]、λ噬菌体DNA在宿主体内生活方式

（1）溶源方式：λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌DNA中，伴随大肠杆菌DNA复制而复制，这种方式是λ噬菌体DNA作为基因工程载体理论依据。

（2）溶菌方式：λ噬菌体感染大肠杆菌后，终止了大肠杆菌染色体DNA所控制遗传信息表示，并深入分解大肠杆菌DNA，最终造成大肠杆菌完全溶解。基因工程制药新版第47页[B]、λ噬菌体DNA结构λ噬菌体基因组基因工程制药新版第48页基因组长度：约为50kb双链DNA分子，实际大小为48502bp。DNA是线状双链分子带有单链互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端（cos序列）。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子经过cos而成环状。61个基因，每个基因平均为1000bp，其中32个较为主要，它们分布和排列与其功效有一定关系。基因组分为二个别：

（1）其中二分之一基因，控制着生命活动周期。

（2）另二分之一基因，可被外源性目标基因所取代，而不影响噬菌体生命活动。基因工程制药新版第49页基因组分为几个不连续区域，三个片段组成：（1）左臂，19.6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，A～J12基因都是组成外壳蛋白基因。（2）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。（3）右臂，9kb～11kb，含λDNA复制和溶菌相关蛋白编码基因。与裂解相关S和R基因、与DNA复制相关O基因和P基因等分别聚集在一起。噬菌体左右两臂包含了λ复制和成熟所必须全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，即位于J基因和N基因之间片段可被其它大肠杆菌DNA片段所替换。基因工程制药新版第50页λ噬菌体基因组非必需区基因工程制药新版第51页基因工程制药新版第52页（2）λ噬菌体DNA改造野生型λ噬菌体DNA分子较大，其结构基因也很复杂，而且经常容纳不下分子量更大外源性目标基因DNA片段。需要对其进行改造。改造方法：（1）遗传学方法-------将λ噬菌体DNA交替地在不含质粒大肠杆菌、和含质粒大肠杆菌宿主内生长，来删去其过多限制酶位点。（2）体外删除法-------将λ噬菌体DNA在体外进行限制酶消化，再将未被切割个别经过蛋白质包装后，去感染大肠杆菌。经过几代连续培养之后，λ噬菌体DNA就会失去不需要限制酶位点。基因工程制药新版第53页（3）λ噬菌体DNA体外包装[A]、体外包装作用[B]、λ噬菌体DNA包装原理[C]、λ噬菌体DNA包装过程

基因工程制药新版第54页[A]、体外包装作用

λ噬菌体DNA连接上外源性目标基因，就成为重组DNA分子，不过，重组之后DNA分子必须经过包装，加上蛋白质外壳形成完整病毒颗粒，才含有感染宿主能力。基因工程制药新版第55页[B]、λ噬菌体DNA包装原理λ噬菌体DNA头部蛋白+重组DNA分子+λ噬菌体DNA尾部蛋白，在适当条件下混合，就能够自动地包装成完整λ噬菌体病毒颗粒。基因工程制药新版第56页（4）λ噬菌体载体构建（A）

缩短长度（B）改造酶切位点（C）增加选择标识基因工程制药新版第57页（A）

缩短长度基因工程制药新版第58页插入型载体：①失去了非必需区②仅保留了EcoRⅠ单一切点③切点又位于汇报基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，汇报基因失活，即可依此进行重组体筛选④可插入长度为10kb外源DNA只含一个限制性位点可供插入外源DNA载体，这类λ噬菌体载体称插入型载体。基因工程制药新版第59页注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：

37kb~51kb。λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常见于外源目标基因克隆。基因工程制药新版第60页置换型载体置换型载体：可被外源DNA置换λ噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点载体，称为置换型载体。适用基因组克隆基因工程制药新版第61页特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA能够被外源置换而不会影响λphage裂解生长能力。包装限制：λphage头部外壳蛋白容纳DNA能力上限≤105%，下限≥75%。包装范围[51kb,36kb].只有λDNA长度大于野生型λphageDNA长度75％而不超出其105％时，才能被包装成phage颗粒，当DNA长度短于野生型75%或超出105%时，phage活性就急剧下降，故要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在36～51kb之间。λ载体必要区是28kb,理论上克隆能力为23kb.基因工程制药新版第62页（B）改造酶切位点野生型λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。为了便于各种起源DNA片段克隆，还需要增加一些单一酶切位点。基因工程制药新版第63页（C）增加选择标识基因工程制药新版第64页加装选择标识lacZ基因工程制药新版第65页（5）λ噬菌体载体使用重组λDNA构建

(酶切，连接）λ噬菌体体外包装λ噬菌体侵染大肠杆菌重组λDNA分离基因工程制药新版第66页（6）λ噬菌体载体优点容量大，装载能力可达23kb，便于构建基因文库重组子筛选较为方便DNA提取操作较为简便基因工程制药新版第67页4：单链DNA噬菌体M13载体M13噬菌体（M13phage）是一个大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，遗传物质是环状单链DNA,全长约6.5kb。宿主是丝状大肠杆菌。它是单链DNA噬菌体中一个经典代表。M13感染细菌后，经过复制转变为双链复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。噬菌体M13感染宿主之后，在含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）X-gal培养基中生长时，会形成蓝色噬斑。经过蓝色噬斑出现能够显示噬菌体M13存在。感染宿主之后，噬菌体M13所释放单链DNA可用于制作放射性标识探针，用来检测RNA结构。基因工程制药新版第68页M13噬菌体组成和结构M13噬菌体颗粒是丝状，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。基因工程制药新版第69页M13噬菌体外型呈丝状M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成M13DNA全长6407个核苷酸M13DNA上最少有11个基因2700个外壳蛋白分子M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长M13噬菌体组成和结构基因工程制药新版第70页单链DNA，由6407碱基组成。90%以上序列可编码蛋白质，共有11个编码基因基因间间隔区多为几个碱基。较大间隔位于基因Ⅷ/Ⅲ以及基因Ⅱ/Ⅳ之间，其间有调整基因表示和DNA合成元件。M13噬菌体基因组基因工程制药新版第71页M13噬菌体基因组编码3类蛋白质：①复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ）②形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ）③结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）基因工程制药新版第72页M13噬菌体载体构建

M13噬菌体作为载体主要特点：①M13噬菌体感染与释放不会杀死宿主菌，仅造成宿主菌生长迟缓；②M13噬菌体DNA在宿主菌内既能够是单链也能够是双链，经过感染或转化方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中；③M13噬菌体包装不受DNA大小限制，其噬菌体颗粒大小可随DNA大小而改变，即使DNA大小比本身DNA大小超出6倍，仍能进行包装。基因工程制药新版第73页⑤M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态RFDNA：单链DNA酶切和连接是比较困难。⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间508bp间隔区----M13不像λ噬菌体基因组那样含有较大可替换区。它基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间）。基因工程制药新版第74页5：人工质粒载体--科斯质粒1978年Collins和Hohn构建一个新型大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid(柯斯质粒)，又叫粘粒。

柯斯质粒（cosmid）=cos序列+质粒。实际是质粒衍生物，它是用正常质粒同λ噬菌体cos位点组成。[A]、科斯质粒基础组成[B]、科斯质粒特征[C]、科斯质粒用途基因工程制药新版第75页Cos质粒（考斯质粒Cosmid）基因工程制药新版第76页[A]、科斯质粒基础组成（1）含有λ噬菌体DNA粘性末端序列（COS序列）。（2）含有质粒一个复制起始区。（3）含有质粒一个抗药性标识。（4）含有各种限制性内切酶单一性切点。基因工程制药新版第77页柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和λ噬菌体cos位点一段DNA组成。包装时，cos位点打开而产生λ噬菌体粘性末端。因为pHC79有pBR