发酵菌种的制备

关于发酵菌种的制备发酵工程第一章发酵工程总论第二章发酵设备第三章发酵工业原料及其处理第四章发酵工业灭菌第五章发酵菌种的制备第六章发酵工业放大第七章微生物发酵机制第八章发酵动力学第九章发酵过程工艺控制第十章发酵染菌及防治第十一章发酵工业废物、废水处理和资源化技术第十二章展望第2页,共70页，2024年2月25日，星期天1发酵工业微生物菌种的选育2工业微生物种子的扩大培养3种子培养基及其制备第五章发酵菌种的制备2/jing/C76/zcr-1.htm第3页,共70页，2024年2月25日，星期天1.1工业微生物的特点1.2发酵工业对菌种的要求1.3工业生产常用的微生物菌种1.4工业微生物菌种的分离1.5发酵高产菌种的选育1.6菌种的退化与保藏1发酵工业微生物菌种的选育第五章发酵菌种的制备第4页,共70页，2024年2月25日，星期天1.1工业微生物的特点1发酵工业微生物菌种的选育

一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种、合适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制，其中菌种是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良性能而考虑和设计的。能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能力强、易变异改造等特点。第5页,共70页，2024年2月25日，星期天1.2发酵工业对菌种的要求1)能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且产量高；2）培养条件易于控制；3）生长速度快，发酵周期短；4）满足代谢控制的要求；5）抗噬菌体和杂菌的能力强；6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化；7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义；8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳源利用；9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。第6页,共70页，2024年2月25日，星期天

地球上的微生物资源非常丰富，目前已发现的仅占其总数的1%~5%，而在工业生产中被利用的仅有数百种，分属于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌、藻类。1.3工业生产常用的微生物菌种第7页,共70页，2024年2月25日，星期天放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：已工业化产品生产菌的介绍1.3工业生产常用的微生物菌种第8页,共70页，2024年2月25日，星期天二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。20世纪50-60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：1.3工业生产常用的微生物菌种已工业化产品生产菌的介绍第9页,共70页，2024年2月25日，星期天HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶1.3工业生产常用的微生物菌种二、氨基酸生产有关的微生物第10页,共70页，2024年2月25日，星期天氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，简单谷氨酸发酵的菌种：其他氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌1.3工业生产常用的微生物菌种二、氨基酸生产有关的微生物第11页,共70页，2024年2月25日，星期天三、食品酶制剂生产有关的微生物

开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌1.3工业生产常用的微生物菌种已工业化产品生产菌的介绍第12页,共70页，2024年2月25日，星期天三、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌沙门氏菌

生长迅速、蛋白产量高;

表达蛋白的纯化、分离及分析快速；

外源基因的导入相对容易；

已建立了整套表达理论及技术。已工业化产品生产菌的介绍1.3工业生产常用的微生物菌种第13页,共70页，2024年2月25日，星期天(二)真核细胞表达系统

酵母(既是微生物又是真核细胞)

生长迅速，营养要求不高，易培养；

安全性好；

比哺乳动物细胞操作简单；

具有一定的修饰蛋白的能力。1.3工业生产常用的微生物菌种已工业化产品生产菌的介绍第14页,共70页，2024年2月25日，星期天

中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统

具有准确的转录后修饰功能；

具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；

具有重组基因的高效扩增和表达能力；

具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；

CHO很少分泌自身的内源蛋白。1.3工业生产常用的微生物菌种已工业化产品生产菌的介绍第15页,共70页，2024年2月25日，星期天微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Elililly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：1.3工业生产常用的微生物菌种已工业化产品生产菌的介绍第16页,共70页，2024年2月25日，星期天一、菌种分离的一般过程样品采集预处理→增殖培养→纯培养→菌种的鉴定问题：如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物1.4工业微生物菌种的分离→→生产性能测定复合酶系复合菌系第17页,共70页，2024年2月25日，星期天二、采样时要注意的问题

气候、水分、空气

来源要广

结合产品的特点

标签：地点、时间、气候等1.4工业微生物菌种的分离第18页,共70页，2024年2月25日，星期天富集的三种方案：

定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑，

不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法1.4工业微生物菌种的分离第19页,共70页，2024年2月25日，星期天定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，但主要是通过培养的方法1.4工业微生物菌种的分离三、目的微生物富集的一些基本方法2/jing/C76/zcr-1.htm第20页,共70页，2024年2月25日，星期天定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批、连续）后使目的微生物在种群中占优势。三、目的微生物富集的一些基本方法第21页,共70页，2024年2月25日，星期天四、菌落的选出

从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素

从形态的角度

菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。1.4工业微生物菌种的分离第22页,共70页，2024年2月25日，星期天实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）→80℃30min处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4d，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型↓1.4工业微生物菌种的分离第23页,共70页，2024年2月25日，星期天实例：醛肟水解酶的筛选--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培养基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2~3d移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离菌落1.4工业微生物菌种的分离第24页,共70页，2024年2月25日，星期天五、目的微生物富集方法的研究进展

分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等

目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%，微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。

陈文新（科学院院士），2002

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～811.4工业微生物菌种的分离第25页,共70页，2024年2月25日，星期天目的

提高生产能力

提高产品质量

开发新产品

解决生产实际问题

防止菌种退化1.5发酵高产菌种的选育第26页,共70页，2024年2月25日，星期天方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易位PCR、同序法DNAShuffling等1.5发酵高产菌种的选育第27页,共70页，2024年2月25日，星期天自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9。自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。一、自然选育1.5发酵高产菌种的选育第28页,共70页，2024年2月25日，星期天自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？1.5发酵高产菌种的选育第29页,共70页，2024年2月25日，星期天自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落发酵试验1.5发酵高产菌种的选育注意形态的观察选择性培养法随机分离法平板划线法平板稀释法第30页,共70页，2024年2月25日，星期天二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂（P103）诱变剂物理：紫外，快中子，射线，激光化学：硫酸二乙酯（DES），亚硝基胍（NTG）生物：噬菌体，转座子1.5发酵高产菌种的选育第31页,共70页，2024年2月25日，星期天（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题

化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂的选择出发菌株的选择（一）、诱变育种的原理诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH二、诱变育种第32页,共70页，2024年2月25日，星期天（三）、诱变育种的一般步骤（P103）二、诱变育种诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到达到高产菌株。第33页,共70页，2024年2月25日，星期天（三）、诱变育种的一般步骤二、诱变育种出发菌株的选择制备菌悬液诱变处理突变菌株的筛选营养缺陷型突变菌株的筛选抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株的筛选组成型突变株的筛选抗性突变株的筛选自然界直接分离到的野生型菌株经历过生产条件考验的菌株已经历多次育种处理的菌株随机筛选形态理化性质第34页,共70页，2024年2月25日，星期天HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型：如Thr缺陷型第35页,共70页，2024年2月25日，星期天黄色短杆菌F9-50的诱变谱系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l第36页,共70页，2024年2月25日，星期天三、基因的直接进化(directedevolution)

突变

基因突变库的建立

筛选

基因突变库的筛选

基因复制与遗传步骤：

在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。1.5发酵高产菌种的选育第37页,共70页，2024年2月25日，星期天主要应用：酶活性能的提高:生理环境→工业催化环境pH

温度

有机溶剂

底物专一性第38页,共70页，2024年2月25日，星期天脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光学拆分选择性(%)231577581905次错位PCR2次定点突变Reetz(1997)Liebeton(2000)第39页,共70页，2024年2月25日，星期天定点突变第40页,共70页，2024年2月25日，星期天错位PCR第41页,共70页，2024年2月25日，星期天DNA改组(DNAShuffling):指DNA分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组(SexualRecombination)。DNA改组技术(1994)的发明人Stemmer博士，他以5项美国专利为技术支撑点，于1997年创立了专门从事DNA改组研究的公司Maxygen。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司duPont公司、生产抗生素的世界巨头DSM公司和工业酶研究生产之最的Novonordisk公司。此外，迄今为止，Maxygen公司还得到了来自美国国防高级研究计划局(DARPA)和国家科学技术协会(NIST)的5项资助，共计2100万美元。从另一角度反映了DNA改组的重要性及美国政府及商家对DNA改组技术的重视程度。第42页,共70页，2024年2月25日，星期天图1有性PCR法改组DNA的基本程序DNAshuffling第43页,共70页，2024年2月25日，星期天

图2交错延伸法改组DNA的基本程序

DNA

shuffling第44页,共70页，2024年2月25日，星期天XXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXXFragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling第45页,共70页，2024年2月25日，星期天项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNAShuffling与常规定向进化的比较第46页,共70页，2024年2月25日，星期天类型示例特性活性增加倍数潜在应用领域抗体人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药β-内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65℃耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药部分DNAShuffling技术的研究成果第47页,共70页，2024年2月25日，星期天DNA改组(DNAShuffling)技术的应用领域

分类用途进化DNA转基因；疫苗载体；DNA疫苗；表达载体；基因转移载体进化蛋白基因治疗用酶；细胞因子；生长因子；抗体；工业酶进化生物体植物；科研用生物体；化学及药物加工；疫苗有机体；石油加工；除污生物第48页,共70页，2024年2月25日，星期天1）菌种的退化及原因菌种退化：指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。常见的菌种衷退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色的改变，与由于环境条件变化而引起菌落形态和生理上的变异是不同的。1.6菌种的退化与保藏菌种退化的原因：基因突变、变异菌株性状分离、其他因素（温度、湿度、培养基成分及各种培养条件）第49页,共70页，2024年2月25日，星期天1.6菌种的退化与保藏狭义的菌种复壮指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，从而达到恢复该菌原有典型性状的目的。广义的菌种复壮指在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能测定工作，从而逐步提高菌种的生产特性。2）菌种的复壮第50页,共70页，2024年2月25日，星期天一、退化菌种的复壮1.6菌种的退化与保藏

常用的方法是对已退化菌株用一定培养条件进行单细胞分离纯化，从而限制退化菌株在数量上占优势，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。纯种分离的方法常用的有三种：稀释分离法、平板划线法和组织分离法（用于高等真菌）。2）菌种的复壮第51页,共70页，2024年2月25日，星期天1.6菌种的退化与保藏二、通过寄生进行复壮

寄生型微生物的退化可接种到相应寄生体内以提高菌株的活力。三、联合复壮

对退化菌株还可用剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍（NTC）联合处理进行复壮。2）菌种的复壮第52页,共70页，2024年2月25日，星期天3）防止菌种退化的措施合理的育种选用合适的培养基创造良好的培养条件控制传代次数利用不同类型的细胞进行移种传代选择有效的保藏方法1.6菌种的退化与保藏第53页,共70页，2024年2月25日，星期天4）菌种保藏

菌种保藏的意义：是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。1.6菌种的退化与保藏

菌种保藏的原理：根据菌种的生理生化特点，采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸中中和剂等方法，使使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。第54页,共70页，2024年2月25日，星期天4）菌种保藏1.6菌种的退化与保藏

蒸馏水悬浮法斜面低温保藏石蜡油封保藏菌种保藏的方法砂土管保藏冷冻保藏真空冻干保藏寄主保藏（病毒、立克次氏体、螺旋体等不能人工培养）基因工程菌的保藏普通冷冻冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术第55页,共70页，2024年2月25日，星期天小结

涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物(动、植物)才具有大量表达的潜力；

传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；

目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；

基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生物产品开发的进程。1发酵工业微生物菌种的选育第56页,共70页，2024年2月25日，星期天3.1菌体组成和细胞外代谢产物3.2种子培养的培养基选择和配制原则3种子培养基及其制备第二章菌种的制备2/jing/C76/zcr-1.htm第57页,共70页，2024年2月25日，星期天3.1菌体组成和细胞外代谢产物3种子培养基及其制备1）菌体组成：?2）胞外代谢产物胞外产物多达37大类，根据微生物代谢产物和生长繁殖的关系不同，分为两大类：一类是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，称为初级代谢产物，此类产物的生产菌种主要是细菌、酵母、霉菌等。另一类代谢产物与微生物生长繁殖无明确关系，称为次级代谢产物，如抗生素、生物碱、色素等。发酵工业用来生产次级代谢产物的微生物仅有少数几个类群，主要是丝状放线菌、丝状真菌等。

第58页,共70页，2024年2月25日，星期天3.1菌体组成和细胞外代谢产物3种子培养基及其制备3）微生物的营养类型（nutritionaltypes)碳源利用自养型（autotrophs）

异养型（heterotrophs）

能量来源光能营养型（Phototrophs）

化能营养型（chemotrophs）

光能无机自养型（Photo-Lithoautotrophy）

化能有机异养型（Photoorganoheterotrophy）

化能无机自养型（chemoLithoautotro-phy）

化能有机异养型（chemoorganoheterotrophy）

第59页,共70页，2024年2月25日，星期天3.2种子培养的培养基选择和配制原则3种子培养基及其制备1）培养基的营养成分及来源培养基（medium)是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。包括：碳源(sourceofcarbon)

氮源(sourceofnitrogen)无机盐(inorganicsalt)生长因子(growthfactor)水(water)第60页,共70页，2024年2月25日，星期天3.2种子培养的培养基选择和配制原则3种子培养基及其制备2）培养基的类型和用途来源：天然培养基（complexmedium；undefinedmedium）

合成培养基（syntheticmedium；definedmedium）

半合成培养基（semidefinedmedium）

外观：固体培养基（solidmedium）

液体培养基（liquidmedium）

半固体培养基（semisolidmedium）

功能：孢子培养基（sporemedium）和种子培养基。第61页,共70页，2024年2月25日，星期天3.2种子培养的培养基选择和配制原则3种子培养基及其制备3）培养基的配制原则选择适宜的营养物质、营养物质浓度及配比合适、选择合适的pH、氧化还原电势、营养成分的加入顺序（先加缓冲化合物，溶解后加入主要物质，然后加入维生素、氨基酸等生长素类的物质）。2/jing/C76/zcr-1.htm第62页,共70页，2024年2月25日，星期天3.2种子培养的培养基选择和配制原则3种子培养基及其制备4）培养基成分配比的选择种子和孢子培养的目的是获得大量质量良好的菌体或孢子，因此产量提高是选择培养基的一个重要标准。

C/N比来源丰富、价格便宜、取材方便方法：单因子试验、正交试验、均匀试验、影响面法第63页,共70页，2024年2月25日，星期天本章思考题1工业用微生物的要求有哪些？试举例说明微生物在工业中的应用。2简述自然分离微生物的一般操作步骤。3简述种子扩大培养的一般步骤。4如何防止菌种衰退？菌种复壮的措施有哪些？5影响种子质量的因素有哪些？如何控制种子质量？第64页,共70页，2024年2月25日，星期天《2008中国大学评价研究报告》还发布了“2008中国最受媒体关注大学排行榜”，排行榜以2007年度高校网络新闻搜索的数量统计得出，位居前十强的高校是北京大学、清华大学、中国人民大学、复旦大学、浙江大学、中山大学、北京师范大学、上海交通大学、武汉大学、同济大学。第65页,共70页，2024年2月25日，星期天中国一流大学名单校名入选根据清华大学研究1型、工学第1名北京大学研究1型、理学第1名浙江大学研究1型、工学第2名南京大学研究1型、理学第2名北京师范大学研究1型、教育学第1名

上海交通大学研究1型、工学第3名中国科术大学研究1型、理学第3名复旦大学研究1型、医学第3名校名入选根据天