实验五转基因植物的检测

关于实验五转基因植物的检测1、检测外源基因在植物细胞中的转录，对外源基因表达调控进行研究，掌握引物的选择、cDNA的合成、RT-PCR检测的原理与方法。。实验目的第2页,共29页，2024年2月25日，星期天第3页,共29页，2024年2月25日，星期天第4页,共29页，2024年2月25日，星期天第5页,共29页，2024年2月25日，星期天第6页,共29页，2024年2月25日，星期天第7页,共29页，2024年2月25日，星期天第8页,共29页，2024年2月25日，星期天第9页,共29页，2024年2月25日，星期天第10页,共29页，2024年2月25日，星期天第11页,共29页，2024年2月25日，星期天第12页,共29页，2024年2月25日，星期天第13页,共29页，2024年2月25日，星期天第14页,共29页，2024年2月25日，星期天第15页,共29页，2024年2月25日，星期天1、材料：转基因植物的RNA或mRNA制备物。非转化的植株材料总RNA或mRNA制备物2、设备：PCR仪、移液器、PCR管等。3、试剂：10×RT缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，OligodT;特异引物)、10×OneStepRNAPCRBuffer、25mMMgCl2、10mMdNTP、RNaseInhibitor(40U/μl)、AMV-OptimizedTaq1μl、AMVRTaseXL(5U/μl)、上游特异Primer(20μM)*1、下游特异Primer(20μM)*2、RNaseFreeH2O。实验材料、设备及试剂第16页,共29页，2024年2月25日，星期天实验操作步骤：1）RNA提取：

关键防止RNA降解RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤。第17页,共29页，2024年2月25日，星期天2、cDNA第一链的合成：取1个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：10×PCRBuffer1μlRNaseFreedH2O5.75μldNTP1μlRNaseInhibitor0.25μlAMVRTaseTranscriptase0.5μloligodT-Adaptorprimer0.5μlRNA1μlTotal10μl实验步骤第18页,共29页，2024年2月25日，星期天反应条件：

42℃30min99℃5min5℃5min第19页,共29页，2024年2月25日，星期天3、PCR反应取一个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：

10×PCRBuffer

4μl

灭菌蒸馏水9μl

10mMdNTP２.5μl

Taq酶0.1μl

上游特异Primer(20μM)*1

0.2μl

下游特异Primer(20μM)*2

0.2μl

Total16μl

将（1）的反应结果稀释20倍，取10μl加入到（2）管中，轻轻摇匀。第20页,共29页，2024年2月25日，星期天反应条件：94℃2min94℃30s55℃30s72℃1min72℃7min30Cycles第21页,共29页，2024年2月25日，星期天目前研究转基因植物外源基因转录表达的常用方法1、RT-PCR(RNA)

2、Northernblot(RNA)

3、real-timePCR(RNA

）

第22页,共29页，2024年2月25日，星期天结果与分析利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录；观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。

RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果第23页,共29页，2024年2月25日，星期天1、将实验结果粘到实验报告上。2、如何选择RT-PCR的反转录引物。3、结合实验结果，试论应用RT-PCR研究外源基因转录表达的优缺点。实验报告第24页,共29页，2024年2月25日，星期天实验一、质粒三种提取方法的比较为什么要用对数期的菌液提取质粒？因为对数期菌的生长状况和数量最佳,有利于提取质粒

溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用？溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去溶液Ⅱ0.2MNaOH/1%SDS破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。溶液Ⅲ3M醋酸钾/2M醋酸这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀第25页,共29页，2024年2月25日，星期天溶菌酶的作用作用?沸水加热的作用?利用溶菌酶和TritonX-100破坏细胞壁,加热可使蛋白质和染色体DNA变性.将实验电泳结果粘到实验报告上，并对结果分析。比较三种提取方法的区别？第26页,共29页，2024年2月25日，星期天实验二、醋酸锂法转化酵母细胞观察并描述培养状况，统计单菌落个数。比较酵母细胞转化与大肠杆菌细胞转化的区别。酵母菌属于真核生物,大肠杆菌是细菌属于原核生物.酵母转化在室温，大肠杆菌转化在冰上酵母转化用醋酸锂，大肠杆菌转化用氯化钙酵母转化用穿梭质粒，大肠杆菌转化用普通质粒穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。比如说通常能够在哺乳动物，酵母或者其他细菌复制表达的质粒，同时可以在大肠杆菌内复制。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。第27页,共29页，2024年2月25日，星期天实验三、侵染菌种对除菌抗生素的敏感性头孢酶素100200300400500600头孢唑啉钠------头孢哌酮钠------头孢曲松钠-++++++++++++++++头孢噻肟钠--+++++++++++++-：表示无抑制作用；