一种检测炭疽芽孢杆菌的方法

一种检测炭疽芽孢杆菌的方法专利名称：一种检测炭疽芽孢杆菌的方法技术领域：本发明涉及一种检测炭疽芽孢杆菌的方法。背景技术：炭疽是严重威胁人类健康的烈性传染病，其病原体为炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)。由于其高毒性，炭疽杆菌是一种潜在的生物武器，曾被帝国主义作为致死战剂之一。目前，皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不应放松警惕。因此，发展快速、灵敏的炭疽杆菌检测方法具有重要意义。卩遼菌体裂解酶(bacteriophagelysins)是卩遼菌体在感染宿主菌末期表达的蛋白质，它通过水解细菌细胞壁的肽聚糖使子代噬菌体释放。Y噬菌体裂解酶(PlyG)能够特异性地杀死炭疽杆菌，同时也能够裂解蜡样芽孢杆菌RSVFl菌株，且RSVFl菌株是唯一对PlyG敏感的蜡样芽孢杆菌菌株。MiriYemini等人就曾以RSVFl菌株为模型，研究了基于噬菌体的炭疽杆菌检测方法。李曼等人也RSVFl菌株为模型进行了杀灭试验的相关研究。发明内容本发明的目的是提供一种检测炭疽芽孢杆菌的方法。本发明提供了一种用于定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl的试剂盒，包括PlyG蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b):(a)定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl；(b)定量检测炭疽芽孢杆菌。所述PlyG蛋白为如下(I)或(2):(I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解酶活性的由序列I衍生的蛋白质。所述试剂盒还可包括Iuc蛋白。所述Iuc蛋白为如下(3)或(4):(3)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(4)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有荧光素酶活性的由序列3衍生的蛋白质。所述试剂盒还可包括D-荧光素。所述试剂盒还可包括Profile-13560(10X)ATP微生物快速检测系统。所述试剂盒还可包括记载有如下公式的载体:y=l.2587X-3.2879，x代表蜡样芽孢杆菌RSVFl总数以10为底的对数值，y代表发光值以10为底的对数值。所述试剂盒还可包括记载有如下公式的载体:y=l.2587X-3.2879，x代表炭疽芽孢杆菌总数以10为底的对数值，y代表发光值以10为底的对数值。本发明还保护以上任一所述的试剂盒在定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl中的应用。应用以上所述试剂盒检测蜡样芽孢杆菌RSVFl时，每个反应可以采用50μID-荧光素/荧光素酶混合溶液、50μIPlyG蛋白浓度为0.09mg/ml的PlyG蛋白稀释液和50μI待测菌液。本发明还保护以上任一所述的试剂盒在定量检测炭疽芽孢杆菌中的应用。应用以上所述试剂盒检测炭疽芽孢杆菌时，每个反应可以采用50μID-荧光素/荧光素酶混合溶液、50μIPlyG蛋白浓度为0.09mg/ml的PlyG蛋白稀释液和50μI待测菌液。本发明还保护所述PlyG蛋白在制备定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl的试剂盒中的应用。本发明还保护所述PlyG蛋白在制备定量检测炭疽芽孢杆菌的试剂盒中的应用。目前以ATP生物发光法定量检测细菌的研究往往采用细胞裂解液来裂解细菌从而释放ΑΤΡ，大多不具有特异性和专一性。本发明以噬菌体裂解酶(PlyG)和荧光素酶(Iuciferase)为关键工具，以蜡样芽孢杆菌RSVFl为模型，建立了荧光发光值与细菌数量之间的线性关系且二者相关性显著(R2=0.9898)。本发明所建立的方法具备灵敏度高、特异性强、检测快速等优点，为特异性定量检测炭疽杆菌的研究及试剂盒开发奠定了基础。对特异定量检测炭疽杆菌的研究提供了有力的理论支持。图1为PCR扩增得到的PlyG、Iuc基因片段；M:BM2000DNAMarker；1=PlyG基因片段；2:luc基因片段。图2为重组质粒pET22b_PlyG和重组质粒pET_luc的双酶切鉴定结果；Ml:BM2000DNAMarker；1:重组质粒pET22b_PlyG的双酶切鉴定结果；2:重组质粒pET22b_luc的双酶切鉴定结果；M2:1kbLadderDNAMarker。图3为SDS检测裂解酶与荧光素酶的表达纯化结果；Ml:蛋白质Marker(低)；M2:蛋白质Marker(宽)；1:将质粒pET22b(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的对照菌进行步骤4得到的上清液；2:重组菌甲步骤4得到的上清液；3:纯化后的PlyG蛋白液；4:重组菌乙步骤4得到的上清液；5:纯化后的Iuc蛋白液。图4为裂解酶的酶活性检测。图5为以平板计数的细菌总数的对数值[Ig(Cfu)]为X轴，以发光值的对数值[Ig(RLU)]为Y轴，制作的X、Y散点图描绘关系曲线。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。裂解酶(又称PlyG蛋白)如序列表的序列I所示，其cDNA的开放阅读框如序列表的序列2所示。荧光素酶(又称Iuc蛋白)如序列表的序列3所示，其cDNA的开放阅读框如序列表的序列4所示。限制性内切酶Nde1、EcoRI_HF和T4DNA连接酶购自NEB公司。2XTransTaqHiFiPCRSuperMixII购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司；DNAMarker、ProteinMarker和质粒提取试剂盒均购自北京博迈德生物技术有限公司。BHI(BrainHeartInfusion)培养基购自美国BD医疗器械有限公司。蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)RSVFl=ATCC编号为4342;参考文献:AbacteriolyticagentthatdetectsandkillsBacillusanthracis,RaymondSchuch,DanielNelson&VincentA.Fischetti，NATURE|V0L418|22AU⑶ST2002，www.nature,com/nature,884-889。质粒pET22b(+):购自Novagen公司，产品编号:69744-3。大肠杆菌BL21(DE3):北京全式金生物技术公司。突光素酶检测试剂盒:购自Promega公司，产品目录号:E1500。D-突光素(BeetleLuciferin,PotassiumSalt):购自Promega公司，产品目录号为E1601。Profile-13560(10X)ATP微生物快速检测系统:购自北京浩正智信科技有限公司。实施例1、裂解酶和荧光素酶的制备一、重组质粒的构建1、重组质粒pET22b_PlyG的构建(I)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子，将合成的双链DNA分子作为模板，用PlyG-F和PlyG-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1的泳道I。PIyG-F:5，-GGAATTCCATATG|CATCACCATCACCATCAC[ATGGAAATCCAA-3，；PIyG-R:5，~CGGAATTCTTATTTAACTTCATACCACCAACCTTT~3，。PlyG-F中，下划线标注限制性内切酶NdeI的酶切识别序列，方框标注His_tag的编码序列；PlyG-R中，下划线标注限制性内切酶EcoRI的酶切识别序列。PCR扩增程序:94°C预变性5min；94°C30sec,55°C30sec,72°C45sec,35个循环；72°C延伸7min;4°C恒温。(2)用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切步骤(I)的PCR扩增产物，回收酶切产物。(3)用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切质粒pET22b(+)，回收约5400bp的载体骨架。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pET22b-PlyG0重组质粒pET22b_PlyG的酶切鉴定电泳图(NdeI和EcoRI双酶切)见图2的泳道1，可以观察到约5400bp和约740bp的DNA片段。根据测序结果，对重组质粒pET22b-PlyG进行结构描述如下:在质粒pET22b(+)的NdeI和EcoRI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。2、重组质粒pET22b_luc的构建(I)合成序列表的序列4所示的双链DNA分子，将合成的双链DNA分子作为模板，用Iuc-F和Iuc-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1的泳道2。Iuc-F:5，-GGAATTCCATATG|CATCACCATCACCATCAC(GGATCCATGGAA-3，；Iuc-R:5’-CGGAATTCTTACACGGCGATCTTTC-3’。Iuc-F中，下划线标注限制性内切酶NdeI的酶切识别序列，方框标注His_tag的编码序列；luc-R中，下划线标注限制性内切酶EcoRI的酶切识别序列。PCR扩增程序:94°C预变性5min；94°C30sec，55°C30sec，72°CIOOsec,35个循环；72°C延伸7min;4°C恒温。(2)用限制性内切酶NdeI和E·coRI双酶切步骤(I)的PCR扩增产物，回收酶切产物。(3)用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切质粒pET22b(+)，回收约5400bp的载体骨架。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pET22b_luc。重组质粒pET22b_luc的酶切鉴定电泳图(NdeI和EcoRI双酶切)见图2的泳道2，可以观察到约5400bp和约1700bp的DNA片段。根据测序结果，对重组质粒pET22b-luc进行结构描述如下:在质粒pET22b(+)的NdeI和EcoRI酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的双链DNA分子。二、裂解酶的制备和纯化1、将重组质粒pET22b_PlyG导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌甲。2、挑取步骤I得到的重组菌甲的单克隆，接种至含有ΙΟΟμg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C、200rpm振荡培养至OD6tltlnm=0.6;加入IPTG(使其浓度为lmmol/L)，16°C、200rpm振荡培养24h。3、取步骤2得到的培养体系，IOOOOg离心IOmin,收集菌体沉淀。4、用pH7.2的PBS缓冲液重悬步骤3得到的菌体，超声波破碎处理(使用JY88-1IDN超声波细胞粉碎机，选择60%功率，即功率约为20kHz，处理总时间90min，周期为超声时间5s,间隙时间8s),IOOOOg离心IOmin,收集上清液。5、将步骤4得到的上清液用0.45μm滤膜过滤后进行镍柱纯化。镍柱预装柱:上海生工生物工程有限公司，产品目录号为BSP079-3。纯化过程按照镍柱预装柱的说明书操作，具体如下:(I)打开开关，将柱内的乙醇冲洗干净；(2)用5-10倍柱体积(I柱体积=5ml,Iml树脂可结合6mg蛋白)的N1-Native-O缓冲液平衡柱子，控制流速在lml/min;(3)上样步骤4得到的上清液，收集的液体再过柱一次，控制流速0.5-lml/min；(4)用5倍柱体积的N1-Native-O缓冲液过柱，直至在0D=280nm检测时没有蛋白洗出；(5)用5-10倍柱体积的N1-Native-20缓冲液过柱并收集过柱液，控制流速在Iml/min；(6)用5-10倍柱体积的N1-Native-50缓冲液过柱并收集过柱液，控制流速在Iml/min；(7)用5-10倍柱体积的N1-Native-1OO缓冲液过柱并收集过柱液，控制流速在lml/min；(8)用5-10倍柱体积的N1-Native-250缓冲液过柱并收集过柱液，控制流速在lml/min；(9)用5-10倍柱体积的N1-Native-500缓冲液过柱并收集过柱液，控制流速在lml/min；(10)用5-10倍柱体积的N1-Native-O缓冲液平衡柱子，保存在30%的乙醇中；N1-Native-O缓冲液、N1-Native-20缓冲液、N1-Native-50缓冲液、N1-Native-1OO缓冲液、N1-Native-250缓冲液和N1-Native-500缓冲液均为镍柱预装柱配套出售的组件。收集N1-Native-250缓冲液和N1-Native-500缓冲液过柱后的液体并合并，即为纯化后的PlyG蛋白液。将质粒pET22b(+)代替重组质粒pET22b_PlyG进行以上步骤1、步骤2、步骤3、步骤4和步骤5，得到的液体作为对照溶液。纯化后的PlyG蛋白液的聚丙烯酰胺电泳图见图3的泳道3。由图3可见:重组菌甲步骤4得到的上清液中在相对分子量27kD处具有特异条带，与已报道的PlyG蛋白大小一致，证明PlyG蛋白实现了可溶性表达；进行镍柱纯化后得到了电泳纯的PlyG蛋白液。纯化后的PlyG蛋白液中的蛋白浓度为0.9mg/ml。三、荧光素酶的制备和纯化1、将重组质粒pET22b_luc导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌乙。用重组菌乙代替重组菌甲进行步骤二的2至5。得到纯化后的Iuc蛋白液。纯化后的Iuc蛋白液的聚丙烯酰胺电泳图见图3的泳道5。由图3可见，重组菌甲步骤4得到的上清液中在相对分子量60kD处具有特异条带，与已报道的Iuc蛋白大小一致，证明Iuc蛋白实现了可溶性表达，进行镍柱纯化后得到了电泳纯的Iuc蛋白液。纯化后的PlyG蛋白液中的蛋白浓度为0.3mg/ml。四、裂解酶的酶活性检测1、用直径为IOcm的培养皿制备装有20ml固体BHI培养基的平板，将半固体BHI培养基于55°C加热(55°C条件为纯液体状态)，取5ml半固体BHI培养基加入500微升对数期的蜡样芽孢杆菌RSVFl菌液，混匀后均匀倒至固体BHI培养基平板上，室温静置lOmin，使其凝固。2、吸取1.5μI步骤二制备的纯化后的PlyG蛋白液，滴加于步骤I的BHI培养基平板的一个点；吸取1.5μIρΗ7.2的PBS缓冲液，滴加于步骤I的BHI培养基平板的另一个点，30°C静置30min，然后30°C倒置培养6h后拍照。照片见图4。滴加纯化后的PlyG蛋白液的区域出现透亮的圆形裂解斑，直径约5mm。滴加PBS缓冲液的区域没有裂解斑产生。五、荧光素酶的酶活性检测1、用PH7.2的PBS缓冲液梯度稀释步骤三得到的纯化后的Iuc蛋白液。2、将10μI稀释液与50μI荧光素酶检测试剂盒中的检测底物混合，置于荧光测定仪器(Profile-13560(IOX)ATP微生物快速检测系统)中测得相对发光单位(RLU)。进行三次重复实验，以测得数值的平均值来表征荧光素酶的相对活性。纯化后的Iuc蛋白液中，Iuc蛋白作为荧光素酶的比活力为3.3X1010RLU/mgo实施例2、制备不同浓度的蜡样芽孢杆菌RSVFl菌液将蜡样芽孢杆菌RSVFl的单菌落接种至3mlLB液体培养基，30°C、200rpm振荡培养12小时，得到PO菌液。用LB液体培养基将PO菌液稀释至10倍体积，即为Pl菌液。用LB液体培养基将PO菌液稀释至20倍体积，即为P2菌液。用LB液体培养基将PO菌液稀释至100倍体积，即为P3菌液。用LB液体培养基将PO菌液稀释至200倍体积，即为P4菌液。用LB液体培养基将PO菌液稀释至1000倍体积，即为P5菌液。用LB液体培养基将PO菌液稀释至2000倍体积，即为P6菌液。用LB液体培养基将PO菌液稀释至10000倍体积，即为P7菌液。用LB液体培养基将PO菌液稀释至20000倍体积，即为P8菌液。用LB液体培养基将PO菌液稀释至100000倍体积，即为P9菌液。实施例3、平板计数法定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl将实施例2制备的PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液或P9菌液分别作为待测菌液进行如下步骤:吸取50μI待测菌液涂布于固体LB培养基平板，37°C倒置培养12小时；每种菌液设置三个重复处理，同时做空白对照。选取菌落数在30-300范围内的稀释度作为标准计算平均值，为平板计数结果。每个待测菌液做三组重复实验，计算平均值为最终结果。PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液和P9菌液含有的蜡样芽孢杆菌RSVFl的浓度见表I。实施例4、应用裂解酶和荧光素酶通过ATP发光法检测蜡样芽孢杆菌RSVFlATP普遍存在于所有活的生物体中，当生物体死亡后，在细胞内酶的作用下，ATP很快被分解掉。所以通过测定样品中的ATP浓度，即可推算出活菌数。荧光素酶以D-荧光素、ATP、O2为底物，将化学能转化为光能，发出荧光。将实施例2制备的PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液或P9菌液分别作为待测菌液进行如下步骤:1、将D-荧光素、实施例1的步骤三制备的纯化后的Iuc蛋白液和pH7.2的PBS缓冲液混合，使D-荧光素浓度为150mg/L,Iuc蛋白浓度为100mg/L,即为D-荧光素/荧光素酶混合溶液。2、用pH7.2的PBS缓冲液将实施例1的步骤二制备的纯化后的PlyG蛋白液稀释至10倍体积，得到PlyG蛋白稀释液。3、取50μI待测菌液，加入过滤比色杯中，比色杯下铺一层滤纸，然后滴加4滴SRA试剂(非细菌细胞释放液)，用压力器对准比色杯顶端，按下压力器把液体压出至滤纸，再次滴加4滴SRA试剂，用压力器对准比色杯顶端，按下压力器把液体压出至滤纸。4、将步骤3得到的比色杯放入3560(10Χ)微光度计的抽屉中，加入50μI步骤2得到的PlyG蛋白稀释液，放置2min以使细菌充分被裂解。5、吸取50μ1步骤1得到的D-荧光素/荧光素酶混合溶液加入到步骤4得到的比色杯中，吸排混匀3次，推回抽屉，记录仪器读数。过滤比色杯、SRA试剂和3560(IOX)微光度计均为Profile-13560(IOX)ATP微生物快速检测系统的组件。每个待测菌液做三组重复实验，计算平均值为最终结果。PO菌液、Pl菌液、P2菌液、P3菌液、P4菌液、P5菌液、P6菌液、P7菌液、P8菌液或P9菌液检出得到的发光值(RLU,relativelightunits)见表I。表I平板计数测得的待测菌液的细菌浓度与ATP发光法检测所得的发光值权利要求1.用于定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl的试剂盒，包括PlyG蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b):Ca)定量检测蜡样芽孢杆菌RSVFl；(b)定量检测炭疽芽孢杆菌；所述PlyG蛋白为如下(I)或(2):(O由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有裂解