粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶蛋白编码序列的制作方法

粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶蛋白编码序列的制作方法专利名称：粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶蛋白编码序列的制作方法技术领域：本发明涉及检测样品中是否存在粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶基因核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶基因核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。本发明的粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。—旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变弓|入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhaseP印tideSynthesis,WHFreemanCo.，SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明在提高粘毛黄芩黄酮类化合物含量上具有明显的作用。提高该化合物的产量，以满足全世界对黄芩苷等药物的巨大需求。因此，本发明具有很大的应用价值。具体实施例方式下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等《分子克隆实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶的克隆1.组织分离(isolation)粘毛黄吝从山西大学购买，将种子播种于温室中，待粘毛黄吝苗长至10cm高时，准备抽取DNA或RNA。2.RNA的分离(RNAisolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀桨器内。匀桨后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA(TRIzolReagents,GIBC0BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。3.基因的全长克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根据各种植物的二氢黄酮醇4-还原酶基因的核苷酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Clontech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)核心片断的克隆PCR[BPOOl[5，_GA(T/C)CC(T/C)GAGAATGA(G/A)GT(G/A)AT(T/A/C)AA-3，]+BP002[5，-TC(C/T)A(G/A/C)ATG(T/C/G)ACA(T/A)A(C/T)TG(C/A/T)CCTTG-3，]]得到416bp的核心片断，回收后连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知黄芩的DFR基因的同源性很高，故初步认为它是一个二氢黄酮醇4-还原酶基因。(2)3，-RACE第一轮PCR[AP+BP003(5，-AATCTTGGCTGAGAAAGCAGCA-3')]连同第二轮PCR[AP+BP004(5'-CCCACCTAGCTTGATCACTGCA-3')]得到757bp3，端序列，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与黄芩的DFR基因的同源性很高，故初步认为它是一个二氢黄酮醇4-还原酶基因。(3)5，-RACE第一轮PCR[UMP+BP005(5，-TCCAGGTCACTCCAACTGGTTTC-3，)]连同第二轮PCR[(NUP+BP006(5'-CATCCCCTCAACCGTTGGCTTG-3')]得到201457bp5，端序列，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与白苏的DFR基因的同源性很高，故初步认为它是一个二氢黄酮醇4-还原酶基因。将测序结果的重叠区拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增DFR编码区(BP007F1(5，-ATGCCTTTGGTAACCACCATGG_3，)+BP007R1(5，-TCTGAGAAGTCGATCGAGGTGT-3'))得到DFR的编码区(777bp)。BLAST的结果证明从粘毛黄芩中新得到的基因确为一个二氢黄酮醇4_还原酶基因。由于已知的同源二氢黄酮醇4-还原酶基因具有将二氢黄酮醇还原生成无色花色素的功能，故推测此基因具有相同的功能。通过组合使用上述3种方法，获得了候选的粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶的全长编码序列。在拼接得到全长(包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物BP008F1:5，-ACGCGGGGACAATCCTTGGCAT-3'(SEQIDNO.1)为正向引物，BP009Rl:5，-AATCCCAACGCAGCACTTACAT-3'(SEQIDNO.2)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为94。C预变性2min;然后94变性45s、55退火45s、72延伸2min;30个循环；最后72延伸lOmin;电泳检测PCR产物，获得扩增片断长度为1283bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆，测序，获得SEQIDNO.3所示的序列。实施例2粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶基因序列信息与同源性分析本发明新的二氢黄酮醇4-还原酶基因序列全长cDNA的长度为1283bp，详细序列见SEQIDNO.3，其中开放读框位于90-866位核苷酸(777个核苷酸)。根据全长cDNA推导出粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶氨基酸序列，共259个氨基酸残基，分子量为28.59kDa，等电点(PI)为6.18。详细序列见SEQIDNO.4。将粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶基因基因相关的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与白苏二氢黄酮醇4-还原酶基因基因序列在核苷酸水平上具有84%的相同性(附表2);在氨基酸水平上，它与白苏二氢黄酮醇4-还原酶基因DFR在蛋白水平上具有81%的相同性，(附表3)。由此可见，粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶基因与白苏二氢黄酮醇4-还原酶基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶在黄酮类化合物生物合成途径上也具有相似的作用。实施例3粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶蛋白或多肽在粘毛黄芩中进行真核细胞表达及转基因植株中黄芩苷含量的检测。含目的基因的表达载体的构建，根据粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶基因编码序列(SEQIDN0.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA1304)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化粘毛黄芩。1.发苗采取粘毛黄芩成熟的种子，用0.1%(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗6次；将粘毛黄芩种子接种在种子萌发培养基上(培养基盛于150ml的三角瓶中，于12rC灭菌20分钟)，该培养基配方为MS基本培养基，添加30g*L—1蔗糖，调节培养基pH值为5.8，再添加5X琼脂粉。在光照培养箱中培养粘毛黄芩的幼芽，培养条件为25t:，黑暗条件下培养。待种子萌动后，改变培养条件为25t:，12小时光照，光照强度为25iimolm—2s—、等到植株片长到3cm高时可用于遗传转化。2.转化共培养将粘毛黄芩无菌苗的幼嫩叶片用小刀片削成约lcm2放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入共培养基暗培养2天。3.除菌培养共培养结束后，将外植体放入除菌培养基培养。4周继代一次。待除菌培养结束后，转入抗性筛选培养基进行转基因毛状根初步筛选。除菌培养基MS+cb(250mgL—0筛选培养基MS+hygr(30mgL—"4.毛状根的离体培养当毛状根长至大约4cm长时切下，在不含任何植物激素的MS培养基上于25±1.(TC无光照的恒温培养箱中继代培养。每三周继代一次，经过几次继代培养后可进行液体发酵培养，以进一步进行分子检测。5.转基因粘毛黄芩的分子检测毛状根DNA的提取和纯化均参照《分子克隆实验指南》(Sambrook，J.etal1993)根据Fumer等的Ri质粒基因序列分析设计rolB、rolC基因的特异性引物。rolB基因的一对引物为5'-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3'和5'-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3'。rolC基因的一对引物为5'-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3'和5'-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3，。rolB、rolC基因的片段大小分别423bp和626bp。同时对基因进行PCR检测。6.二氢黄酮醇4-还原酶在粘毛黄吝毛状根中的northernblot分析l)RNA的提取利用TRIzol试剂盒(GIBC0BRL，USA)提取并参考《分子克隆实验指南》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)提取粘毛黄芩转基因毛状根各个单克隆的RNA。2)RNA的定量参考《分子克隆实验指南》(Sambrook等，1989)，分光光度计测0D26。；RNA含量计算10D26。=40iigm1—1。3)总RNA琼脂糖凝胶电泳分离①取6ml25X(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。②称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55t:水浴中。③于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55t:的凝胶溶液中，混匀。④迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。⑤将提取的RNA(20iig)溶解于RNA变性溶液中，在65°C下加热IO分钟，然后立即放在冰上。⑥在样品中加入2ulIOX上样缓冲液，混匀。⑦在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。4)RNA尼龙膜上转移①转移之前，将尼龙膜用10XSSC浸泡。②将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2XSSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。③滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。④转移后，将膜于8(TC烘烤2小时。5)膜上杂交信号的检出①将膜浸在5XDendart，s，O.1%SDS，O.lmgm1—1鲑鱼精DNA，65。C下预杂交2小时。②将用GeneImagesContentsCDP-Starlabellingmodule标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入①的杂交液中，于65。C杂交16-24小时。③取出膜，置于洗膜液I(1XSSC，1XSDS)中，于65t:漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液11(0.1XSSC，1%SDS)中于65t:漂洗3次，每次15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照RocheDIGlabeled试剂盒说明书)。7.转二氢黄酮醇4-还原酶的粘毛黄芩毛状根黄芩苷的HPLC分析黄芩苷的提取将培养30d的单克隆毛状根洗净，用吸水纸吸干水分，称鲜重后冷冻干燥30h至恒重，研磨成粉，称取100mg干粉加入10mL甲醇超声破碎20min，过滤，再提取一次，合并滤液，将甲醇提取液浓縮蒸干，用甲醇定容至lOrnl，_20°〇保存，作为供试样品溶液，可用于HPLC分析。高压液相检测标准品的制备精密称取2mg黄芩苷标准对照品，用色谱纯甲醇溶解过滤，配成浓度为1000iigmL—、分别梯度稀释成280、140、70、35、17.5iigmL—、在相应的色谱条件下进样，且每一浓度进样三次，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积对进样量回归分析，得对照品的线性回归方程和标准曲线。高压液相检测条件色谱柱为Symmetry-C18柱(4.6mmX150mm，5ym)，流动相甲醇0.2mo1L—1磷酸二氢钠溶液(45:55)，流速0.8mLmin—、柱温25°C。检测波长280nm。黄吝苷大约在7.7min处出峰。序列表〈110>西南大学〈120〉粘毛黄芩二氢黄酮醇4-还原酶蛋白编码序列〈140〉〈141〉〈160>4〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>22bp〈212>DNA〈213>粘毛黄吝(ScutellariaviscidulaB皿ge)〈400>1ACGCGGGGACAATCCTTGGCAT〈210>2〈211>22bp〈212>DNA〈213>粘毛黄吝(ScutellariaviscidulaB皿ge)〈400>2AATCCCAACGCAGCACTTACAT〈210>3〈211>1283〈212>DNA〈213>粘毛黄吝(ScutellariaviscidulaB皿ge)〈220>1〈221>CDS〈222>(90).(866)〈223〉〈400>3AC2GCGGGGACAATCCTTGGCATTGGTTCAAACTTGTCTTAAMTTTAATATATAGTTCCAAT62CCAACCCMATATCTCACTTCCTAAACATGCCTTTGGTAACCACCATGGCCATGCCACCT122MetProLeuValThrThrMetAlaMetProPro1510CCAGCCACGACAGTATGTGTCACCGGAGCATCTGGCTTCATCGGCTCATGGCTCGTCATG182ProAlaThrThrValCysValThrGlyAlaSerGlyPhelieGlySerTrpLeuValMet15202530AGACTCCTCCAGCATGGTTATATTGTTCGTGCAACTGTTCGTGATCCTGGGMCATGGAG242ArgLeuLeuGinHisGlyTyrlieValArgAlaThrValArgAspProGlyAsnMetGlu35404550MGGTGAMCACCTAACGGAACTGCCACMGCAGACACAMGTTGACACTGTGGAAGGCA302LysValLysHisLeuThrGluLeuProGinAlaAspThrLysLeuThrLeuTrpLysAla55606570GATATGAGCATACMGGAAGCTACGACAMGCAGTACAAGGTTGTGMGGGGTGTTTCAC362AspMetSerlieGinGlySerTyrAspLysAlaValGinGlyCysGluGlyValPheHis75808590ATGGCCACACCTATGGATTTCGMTCCAATGATCCTGAGMTGMGTGATCMGCCAACG422MetAlaThrProMetAspPheGluSerAsnAspProGluAsnGluVallieLysProThr95100105110GTTGAGGGGATGTTGMCATCATAAGATCATGTGCCMAGCCAMACTGTGMGAAATTG482ValGluGlyMetLeuAsnlielieArgSerCysAlaLysAlaLysThrValLysLysLeu115120125130ATATTCACAACCTCAGCAGGGACACTGAATGTTGAAGAACACCAGAMCCAGTTTATGAT542liePheThrThrSerAlaGlyThrLeuAsnValGluGluHisGinLysProValTyrAsp135140145150GAAACCAGTTGGAGTGACCTGGATTTCATTTACTCCMGAMATGACTGGATGGATATAT602GluThrSerTrpSerAspLeuAspPhelieTyrSerLysLysMetThrGlyTrplieTyr155160165170TTTTTGTCTAMATCTTGGCTGAGAMGCAGCAATGGAAGCAACTAMGAGMTAATATC662PheLeuSerLyslieLeuAlaGluLysAlaAlaMetGluAlaThrLysGluAsnAsnlie175180185190MCTTAATTACTGTCATACCACCTCTAGTGGTTGGTCCATTCATCATGCCCACCCTCCCA722AsnLeulieThrVallieProProLeuValValGlyProPhelieMetProThrLeuPro195200205210CCTAGCTTGATCACTGCACTTTCCCCCATTACTGGGMTGAAGCCCACTATTTACTATCA782ProSerLeulieThrAlaLeuSerProlieThrGlyAsnGluAlaHisTyrLeuLeuSer215220225230GGATTCAGTGACAGTCACTCTCMGGGACAAGAACTGGAGCTGMAMGATTCTTACAAT842GlyPheSerAspSerHisSerGinGlyThrArgThrGlyAlaGluLysAspSerTyrAsn235240245250CTACACCTCGATCGACTTCTCAGATMCCATCTCGTTGGMCAATTCCTCAMCAGTTGG902LeuHisLeuAspArgLeuLeuArg:氺265TGAGCTGMATCCCTGTATTTTCTCMCCTCTCCCACAATGCTCTCTCTGGCCACATCCC962ATCATCGATAGGAMTCTACAGMGCTCGAGTCATTGGATCTCTCACTCMCAGTCTCGA1022CGGAGAAATCCCGAGGCAGCTTGCAAGCCTCACGTTCCTCTCATTCTTGAACGTGTCTTA1082CAACCATCTTGTTGGGAGGATCCCAGAAGGGAGCCAMTCCAGACATTTCCAGAGAGTTC1142CTTCATCGGAMCGAGGGGCTTTGTGGGTTTCCTTTGAACMAACCTGCAATGGCACTGG1202MCATCATCATCATCGTCATCGCCGGAGTTTCCACGGGGGMGTTGGAGGGAGAGATATA1262TGTAAGTGCTGCGTTGGGATT1283〈210>4〈211>259〈212>PRT〈213>粘毛黄吝(ScutellariaviscidulaB皿ge)〈400>4MetProLeuValThrThrMetAlaMetProProProAlaThrThrValCysValThrGlyAla15101520SerGlyPhelieGlySerTrpLeuValMetArgLeuLeuGinHisGlyTyrlieValArgAla25303540ThrValArgAspProGlyAsnMetGluLysValLysHisLeuThrGluLeuProGinAlaAsp45505560ThrLysLeuThrLeuTrpLysAlaAspMetSerlieGinGlySerTyrAspLysAlaValGin65707580GlyCysGluGlyValPheHisMetAlaThrProMetAspPheGluSerAsnAspProGluAsn859095100105GluVallieLysProThrValGluGlyMetLeuAsnlielieArgSerCysAlaLysAlaLys110115120125ThrValLysLysLe