酶功能改变方法及其突变体的制作方法

酶功能改变方法及其突变体的制作方法酶功能改变方法及其突变体的制作方法本发明的课题为提供变换中链脱氢酶/还原酶（MDR）家族酶的辅酶依赖性的酶改变方法。此外，本发明的课题为提供通过该改变方法转换辅酶依赖性的MDR家族酶突变体，以及提供应用该酶来以酶法制造光学活性醇的方法。本发明开发新的变换MDR家族酶的辅酶依赖性的酶改变方法，通过该酶改变方法，从将NADH作为辅酶利用的有用的MDR家族酶，合理地设计了将NADPH作为辅酶利用的酶突变体，并提供实际上具有这样的功能的突变体。【专利说明】酶功能改变方法及其突变体【技术领域】[0001]本发明涉及醇脱氢酶的辅酶依赖性的改变方法，特别是中链脱氢酶/还原酶(MDR:Medium-chainDehyrdrogenase/Reductase)的辅酶依赖性的改变方法。【背景技术】[0002]一般而言，在使用了氧化还原酶的光学活性醇类的制造中辅酶是必要的，因此为了避免因反应进行而引起的辅酶枯竭，与氧化还原并行而进行辅酶的有效率的再生是重要的课题。作为光学活性醇类的制造中必要的辅酶，可举出还原型β_烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH，其中，将氧化型记为NADP+)或者还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH，其中，将氧化型记为NAD+)等的吡啶核苷酸辅酶。作为将这些辅酶再生的方法，例如，周知使用葡萄糖脱氢酶(GDH)、甲酸脱氢酶(FDH)等的方法。[0003]以往，尽管存在具有优异的物性(稳定性、耐溶剂性、耐氧化性)、比活性的醇脱氢酶，但是其辅酶依赖性未被最优化，即使将NADPH或者NADH中的任一个再生，光学活性醇类的生产率也受到限制。考虑如果能够将醇脱氢酶的辅酶依赖性最优化为辅酶再生酶的辅酶依赖性，即NADPH型或NADH型中的任一个，则在光学活性醇等的制造中的工艺最优化会变得容易，能够提供更有效率的制造方法。[0004]通过突变筛选取得辅酶依赖性被转换的酶是需要庞大的劳力的，因此进行了考虑酶的立体结构信息来合理地设计辅酶依赖性被转换的酶突变体的尝试(专利文献1、非专利文献I)。[0005]醇脱氢酶(ADH)也可以说是通过该逻辑设计来取得辅酶依赖性被转换的突变体的代表性酶家族。其中，关于氨基酸残基数是250左右的短链脱氢酶/还原酶(SDR:Short-chainDehydrogenase/Reductase)家族的酶,近年已报道了成功地进行辅酶依赖性的转换的例子(非专利文献2、非专利`文献3)。但是，关于氨基酸残基数为350左右的中链脱氢酶/还原酶(MDR)家族，没有相同的报告例。[0006]专利文献[0007]专利文献1:国际公开第03/004653号小册子[0008]非专利文献[0009]非专利文献I=PenningT.M.等著，“Chem.Rev.”，2001年，第101卷，第3027-3046页[0010]非专利文献2:MachielsenR.等著，“Eng.LifeSc1.”,2008年，第9卷，第38-44页[0011]非专利文献3:ZhangR.等著,“Appl.Environ.Microbiol.,2009年，第2176-2183页【发明内容】[0012]本发明的课题为将醇脱氢酶对NADPH或NADH中的任一个的依赖性最优化，提高使辅酶再生系统共同作用时的光学活性醇类的生产率。[0013]但是，不可能将种类、同源性不同的酶的逻辑设计直接适应于MDR。进一步地，作为醇脱氢酶，使用由约350个氨基酸残基构成的MDR(中链脱氢酶/还原酶)家族酶的情况下，导入突变的位置的候补即使在导入I个突变的情况下也存在350处，在导入多个突变的情况下会存在庞大数量的候补。进一步地，在各自的位置中，能够向至少19种氨基酸进行置换，从这些无数的候补中鉴别使对辅酶的依赖性转换而成的突变体是非常困难的。[0014]本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果开发了新的变换属于MDR(中链脱氢酶/还原酶)家族的酶的辅酶依赖性的酶改变方法，成功地将导入突变的位置从多达350处的候补缩小成4处，且从19种存在的天然氨基酸中确定了最优的氨基酸来作为突变后的氨基酸。由此，成功地从NADH/NAD+依赖性MDR(中链脱氢酶/还原酶)家族酶取得的NADPH/NADP+依赖性酶突变体，并从NADPH/NADP+依赖性MDR(中链脱氢酶/还原酶)家族酶取得NADH/NAD+依赖性酶突变体。[0015]gp，本发明涉及:[0016][I]一种蛋白质,属于中链氧化还原酶家族,并具有选自下述的(a)~(d)中的至少一种氣基酸残基:[0017]Ca)与序列号I的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ala或Ser，[0018](b)与序列号I的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Arg，[0019](c)与序列号I的Lys-203在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ser,以及，[0020](d)与序列号I的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys;[0021][2]根据[I]所述的蛋白质，其由与序列号I所示的氨基酸序列具有85%以上的序列同源性的氨基酸序列构成；[0022][3]根据[I]或[2]所述的蛋白质，其中，由在序列号I所示的氨基酸序列中导入有选自下述的(e)~(h)中的至少一种突变的氨基酸序列构成:[0023](e)将Asp-201置换为Ala或Ser，[0024](f)将Lys-202置换为Arg,[0025](g)将Lys-203置换为Ser，以及，[0026](h)将Ala-206置换为Lys;[0027][4]根据[I]~[3]中任一项所述的蛋白质，其由序列号2~8中任一项所述的氨基酸序列构成；[0028][5]由编码[I]~[4]中任一项所述的蛋白质的碱基序列构成的DNA;[0029][6]一种DNA，选自以下(A)、(B)以及(C):[0030](A)由序列号25~31中的任一个所述的碱基序列构成的DNA，[0031](B)与包含与序列号25~31中的任一个所述的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA，[0032](C)与序列号25~31中的任一个所述的碱基序列具有85%以上的序列同源性、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA;[0033][7]一种载体，包含[6]所述的DNA;[0034][8]一种转化体，是用[7]所述的载体转换宿主细胞而得到的；[0035][9][8]所述的转化体的培养物；[0036][10]一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，包括如下工序:用[I]~[5]中任一项所述的蛋白质，使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸进行变换，得到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；[0037][11]一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，包括如下工序:用[I]或[2]所述的蛋白质，变换氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，得到还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；[0038][12]一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，通过使还原酶作用于由[10]所述的方法得到的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸来进行；[0039][13]一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的制造方法，通过使氧化酶作用于由[II]所述的方法得到的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸来进行；[0040][14]根据[10]~[13]中任一项所述的制造方法，其特征在于，利用权利要求8所述的转化体或权利要求9所述的培养物；[0041][15]通过[10]~[14]中任一项所述的制造方法制造的化合物。[0042]由于醇脱氢酶(ADH)，特别是中链脱氢酶/还原酶(MDR)家族的辅酶依赖性得到最优化，因此能够提高使辅酶再生系统共同作用时的光学活性醇类的生产率。[0043]作为NADP+还原酶，近年发现物性优异的源自乳酸菌的⑶H(国际公开第09/041415号小册子)。但是，源自麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)的MDR家族酶RMA由于野生型是NADH依赖性的，因此难以将作为NADP+还原酶的源自乳酸菌的GDH用作辅酶再生酶。与此相对，如果是通过辅酶依赖性的转换而得到的本发明的蛋白质，则能够将源自乳酸菌的作为NADP+还原酶的GDH用作辅酶再生酶，制造工艺构建上的优点极其大。[0044]此外，在将利用NADPH/NADP+依赖性酶的反应和利用NADH/NAD+依赖性酶的反应在一个反应溶液中实施的多阶段反应的情况下，能够改变辅酶依赖性，因此本技术达到反应工艺最优化的优点很大。【专利附图】【附图说明】[0045]图1为本发明的实施例4涉及的反应示意图。[0046]图2为示出本发明的实施例4涉及的反应中的光学活性醇的变换率和光学纯度的分析结果的图。【具体实施方式】[0047]本说明书中，“蛋白质”这一术语是包含具有多肽结构的所有分子的物质，被片段化或通过肽键连接的多肽链也被包含在“蛋白质”这一术语中。[0048]本发明的蛋白质是通过对属于中链脱氢酶/还原酶家族的蛋白质导入氨基酸置换突变而得到的。中链脱氢酶/还原酶(Medium-chainDehydrogenase/Reductase,MDR)家族是属于醇脱氢酶(ADH，ECl.1.1.1.)的家族之一，由350~375个残基构成，基本都含有锌(Zn)。中链脱氢酶/还原酶家族由各种生物信息学数据库(Bioinformaticsdatabase)进行了登记?分类?定义。例如，与PfamChttp://pfam.sanger.ac.uk/)的家族ID“PF00107”相关联的酶全部属于中链脱氢酶/还原酶家族，在2011年4月这一时间点，超过20000个的序列得到登记。属于中链脱氢酶/还原酶家族的酶参与醇发酵、醛解毒、木质素的生物合成、脂肪酸的生物合成或免于氧化损伤的保护等广泛的生理功能。[0049]就属于中链脱氢酶/还原酶家族的蛋白质而言，作为辅酶的吡啶核苷酸是必要的。所谓吡啶核苷酸是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(将还原型记为NADPH，将氧化型记为NADP+)或β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(将还原型记为NADH，将氧化型记为NAD+)。[0050]此外，即使是新发现的未登记的序列，如果与中链脱氢酶/还原酶家族酶的序列同源性高，则也被分类为中链脱氢酶/还原酶家族酶。“序列同源性”是能够通过前述的使用了PROGRAMBLAST的氨基酸序列同源性解析来确定的。在BLAST分析中评价同源性时，可使用E-value这一统计值，同源性越高，该数值越无限接近于O。从序列同源性判断是否是MDR家族酶时，相对于公知的MDR家族酶，E-value优选为IX10_5以下，更优选为IX10,以下，进一步优选为IXIO45以下。用于实施BLAST分析的软件可通过NationalCenterforBiotechnologyInformation(/)进行利用。[0051]作为成为导入氨基酸置换突变的对象的中链脱氢酶/还原酶家族酶，优选为蛋白质序列数据库UniProtKB(http://www.uniprot.0rg/)收载的酶。作为能够应用变换成NADPH/NADP+依赖性的技术的NADH/NAD+依赖性中链脱氢酶/还原酶家族酶，例如可举出源自酵母的ADHl(P00330)、源自芽孢杆菌的ADH-HT(P42328)以及源自人的ADHlβ(Ρ00325)等。同样地，作为能够应用变换成NADH/NAD+依赖性的技术的NADPH/NADP+依赖性MDR家族酶，例如可举出源自酵母的ADH6(Q04894)、源自美国白杨的芥子(sinapyl)ADH(Q94G59)以及源自人的PIG3(Q53FA7)等。应予说明，括号内是前述数据库中的编码号码。[0052]突变导入前的蛋白质优选为由相对于源自麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)的被包含在MDR家族中的酶(国际公开第08/066018号小册子，以下简写为RMA)，具有高的序列同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。“序列同源性”是在相同的区域中完全一致的氨基酸残基数所占的比例，可通过前述的BLAST分析求出，由“Identities”标记。[0053]突变导入前的蛋白·质相对于序列号I的氨基酸序列的序列同源性优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%以上。突变导入前的蛋白质最优选为由序列号I的氨基酸序列构成的蛋白质，该蛋白质是源自麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)的MDR家族酶(国际公开第08/066018号小册子，以下简写为RMA)。RMA例如将NADH作为辅酶，将酮还原，催化生成光学活性醇的反应。在由序列号I的氨基酸序列构成的蛋白质(RMA)中导入氨基酸置换突变而设计本发明的蛋白质的情况下，能够将辅酶依赖性从NADH依赖性转换为NADPH依赖性。本发明是通过利用该RMA(序列号I)的模拟立体结构而实现的。[0054]在立体结构上同等位置的氨基酸残基是指，基于氨基酸序列信息来预测突变导入前的蛋白质的立体结构，与由序列号I的氨基酸序列构成的蛋白质的立体结构进行比较时，与由序列号I的氨基酸序列构成的蛋白质中同等的位置存在的氨基酸残基。[0055]以下，例示使用序列号I作为突变导入前的蛋白质时的氨基酸置换突变的逻辑设计方法。RMA的立体结构的逻辑设计可通过利用RMA的模拟立体结构来实现。应予说明，关于由序列号I所示的野生型RMA，未进行以X射线晶体结构分析为首的结构解析等实验，其立体结构是未知的。[0056]基于RMA的氨基酸序列信息，利用ProgramClustalX(Thompson、J.D.等著，“NucleicAcidRes.”，1994年，第22卷，第4673-80页)，完成与具有氨基酸序列同源性且立体结构被登记在蛋白质数据库(ProteinDataBank,PDB)的酶的多重氨基酸序列比对。与RiA具有氨基酸序列同源性的蛋白质能够通过如下方式进行选择，即，以被登记在PDB的蛋白质的氨基酸序列为对象,使用PROGRAMBLAST(Altschul,S.F.等著，“NucleicAcidRes.”1997年，第25卷，第3389-3402页)或PS1-BLAST(ShafferA.A.等著，“Bioinfomatics”，2000年，第164卷，第88-489页)进行氨基酸序列同源性的检索。[0057]接下来，这些立体结构已知的蛋白质的三元立体结构比对可通过Swiss-PDBViewer(GuexN.等著，“Electrophoresis”，1997年，第18卷，2714-2723)等的三维绘图程序、VASTSearch(GibratJ.F.等著，“Curr.0pin.Struct.Biol.”，1996年，第6卷，377-)等的立体结构比较.类似结构检索服务器进行。首先将仅由氨基酸序列得到的多重比对，基于立体结构的类似性进行修正，将以得到的序列比对为基础被推定为立体结构的类似性高的蛋白质的立体结构(PDB编码:1LLU)作为分子模拟的模板蛋白质进行选择。使该模板蛋白质由ProgramSwissPDB-Viewer表示,按照序列比对，以适于RMA的氨基酸序列(序列号I)的方式进行氨基酸残基的置换。关于插入、缺失部位，从PDB检索最优的类似部分结构，置换为该部分结构，从而构建立体结构模型。[0058]以该立体结构模型为基础，以辅酶结合口袋周围为中心，确定被预测为对与辅酶的结合产生较大影响、且对辅酶结合性以外的功能几乎没有影响的被预测部位(残基)。接下来，通过使NADH以及NADPH虚拟对接的立体结构的模型构建、以及利用了该对接结构的计算化学方法进行的自由能计算，设计对NADH的亲和性降低且对NADPH的亲和性变高的突变。一般而言，关于酶(蛋白质)和辅酶(底物)复合体的稳定性，能够根据自由能进行讨论(A.R.Leach著，“分子模拟概论”，2004年，第11章)。[0059]若利用分子模拟结构(主链的骨架)，则能够通过利用了分子力场法的分子模拟计算(能量极小化计算)来算出辅酶不结合的状态(apo)与辅酶结合的状态(holo)的自由能差分值。该逻辑的详细情况可以说是设计与目标蛋白质结合的药物的方法的应用。LBDD配体?基的自由能差与野生型相比，在NADH的情况下对apo有利,且在NADPH的情况下对holo有利这一趋势特别强的突变可以说对转换辅酶依赖性是有用的。具体地，通过使用ProgramShrike(日本特许公开第2001-184381号公报)的计算机筛选，进行氨基酸突变候补的缩小。[0060]通过上述方法，能够提取在由350个左右残基构成的MDR(中链脱氢酶/还原酶)家族酶中的对辅酶的识别重要的部位，且能够发现为了获得作为目标的辅酶依赖性而最优的各部位的氨基酸的种类(及其组合)。在MDR(中链脱氢酶/还原酶)家族酶中，容易确定与序列号I的第201位、第202位、第203位或第206位在立体结构上同等的位置。利用前述的VASTSearch等立体结构比较.类似结构检索服务器，进行立体结构已知的氨基酸序列(例如，本次发明中使用的PDB编码:1LLU的氨基酸序列)与以立体结构为基础的氨基酸序列的比对，从而能够容易地鉴定在立体结构上同等的位置。该VASTSearch也能够通过美国生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)进行利用。[0061]本发明的蛋白质优选属于中链脱氢酶/还原酶家族，并具有选自下述(a)~(d)中的至少一种氨基酸残基:[0062](a)与序列号I的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ala或Ser，[0063](b)与序列号I的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Arg，[0064](c)与序列号I的Lys-203在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ser,以及，[0065]Cd)与序列号I的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys。[0066]进一步地，更优选属于中链脱氢酶/还原酶家族，并包含下述(e)~(g)中的全部氣基酸残基:[0067](e)与序列号I的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ser，[0068](f)与序列号I的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Arg，以及，[0069](g)与序列号I的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys。[0070]通过上述(a)~(d)或(e)~(g)的突变导入，能够将辅酶依赖性是NADH(或NAD+)依赖性的醇脱氢酶转换为NADPH(或NADP+)依赖性。[0071]突变导入后的蛋白质相对于序列号I的氨基酸序列的序列同源性优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%以上。具体而言，突变导入后的蛋白质优选具有序列号2~8所示的氨基酸序列，更优选具有序列号2~3所示的氨基酸序列。[0072]此外，本发明的蛋白质优选具有醇脱氢活性，并具有选自下述(i)~(I)中的至少一种氨基酸残基:[0073](i)与序列号I的Asp-201在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Asp，[0074](j)与序列号I的Lys-202在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys，[0075](k)与序列号I的Lys-203在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Lys，以及，[0076](I)与序列号I的Ala-206在立体结构上同等位置的氨基酸残基是Ala。[0077]通过上述(i)~(I)的突变导入，能够将辅酶依赖性是NADPH(或NADP+)依赖性的醇脱氢酶转换为NADH(或NAD+)依赖性。[0078]本发明的蛋白质优选相对于突变导入前显示高氧化(或还原，以后简写为“氧化/还原”)活性的辅酶的氧化/还原活性降低。或者，优选相对于突变导入前显示低的氧化/还原活性(或完全不显示)的辅酶的氧化/还原活性提高。进一步地，本发明的蛋白质更优选具有这两方的特征。[0079]所谓辅酶氧化/还原活性比是指，将突变导入后显示依赖性的辅酶的氧化/还原活性，用突变导入前显示依赖性的其他的辅酶的氧化/还原活性去除而得的值。例如，RMA的情况下，辅酶氧化/还原活性比由氧化活性比(NADPH/NADH)表示。辅酶氧化/还原活性比优选为I以上，更优选为5以上，进一步优选为10以上。在希望仅将突变导入后显示依赖性的辅酶有选择地氧化/还原的情况下，可要求严密的辅酶选择性，因此进一步更优选为20以上，在要求更严密的辅酶选择性的情况下，最优选30以上。例如，同时进行利用烟酰胺辅酶依赖性的酶的两个反应时，在相互的酶的辅酶依赖性不同的情况下，通常要求严密的选择性。应予说明，突变导入前的辅酶氧化/还原活性比即使很高，也为0.1左右，如果大于该值，则原本就是在两方显示依赖性的酶。[0080]辅酶氧化/还原活性，在RMA的情况下，是将在I分钟内将IμmoI的NADPH(或NADH)氧化为NADP+(NAD+)的酶活性定义为I个单位而算出的。在突变导入前后，为了算出辅酶氧化/还原活性的反应液组成、酶浓度设为相同条件。辅酶氧化/还原活性的测定条件，在RMA的情况下，优选为pH4.0~10.0、温度为4°C~80°C的一定温度下，一定时间的通气搅拌处理的条件，但是也可以考虑组合的辅酶再生酶的物性来进行设定，并不受到这些条件的限制。本发明的蛋白质若除去辅酶依赖性被转换的特征，则维持例如底物特异性等本来的功能。[0081]本发明的DNA是由编码本发明的蛋白质的碱基序列构成。只要是按照后述的方法，在被导入的宿主细胞内能表达本发明的蛋白质的DNA，就可以为任意的DNA，也可以包含任意的非翻译区域。只要能够设计蛋白质，就能够通过由作为导入突变前的蛋白质的起源的生物，按照本领域技术人员公知的方法取得导入突变前的DNA并导入突变，从而取得本发明的DNA。[0082]向编码野生型MDR家族酶的DNA进行的部位特异性突变的导入，能够使用重组DNA技术、PCR法等进行。利用重组DNA技术的突变的导入，在野生型酶基因中的希望导入突变的目标部位的两侧存在适当的限制酶识别序列的情况下，能够通过盒式突变法进行，所述盒式突变法为用前述制限酶切断此处，将包含希望导入突变的部位的区域除去后，利用化学合成等仅在目标部位插入导入突变的DNA片段。此外，利用PCR进行的部位特异性突变的导入是通过如下方式进行的，即，用在野生型编码基因中的希望导入突变的目标部位导入了目标突变的突变引物和不具有包含前述基因的一个末端部位的序列的突变的扩增用引物来扩增前述基因的单侧，用具有相对于前述突变用引物互补的序列的突变用引物和不具有包含前述基因的另一个末端部位的序列的突变的扩增用引物来扩增另一侧，将得到的两个扩增片段进行退火操作，然后进一步地用前述2种扩增用引物进行PCR操作。除了这些重组DNA技术、PCR法之外，也可以通过化学合成来取得编码导入了突变的氨基酸序列的DNA。[0083]作为这样得到的编码本发明的蛋白质的DNA，例如，可举出由序列号25~31中的任一个所述的碱基序列构成的DNA。[0084]此外，作为本发明的DNA，可举出与包含与序列号25~31中的任一个所述的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA。[0085]此外，作为本发明的DNA，可举出与序列号25~31中的任一个所述的碱基序列具有85%以上的序列同源性、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA。[0086]此处，“与包含与序列号25~31中的任一个所述的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交、且由编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的碱基序列构成的DNA”是通过将包含与序列号25~31中的任一个所述的碱基序列互补的碱基序列的DNA作为探针，在严格条件下使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或者SOUTHERN杂交法等而得到的DNA，且是指编码具有氧化还原酶活性的蛋白质的DNA。[0087]杂交可按照MolecularCloning,Alaboratorymanual,secondedition(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)等中记载的方法进行。此处严格条件下杂交的DNA”可举出，例如通过如下方法取得的DNA，即，通过使用将源自菌落或者噬菌斑的DNA进行了固定化的过滤器，在0.7~1.0M的NaCl存在的条件下、65°C时进行杂交之后，使用2倍浓度的SSC溶液(I倍浓度的SSC溶液的组成由150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠构成)，65°C的条件下，清洗过滤器而取得DNA。优选65°C时以0.5倍浓度的SSC溶液清洗，更优选65°C时以0.2倍浓度的SSC溶液清洗，进一步优选65°C时以0.1倍浓度的SSC溶液清洗而取得的DNA。[0088]虽然记在了以上这样的杂交条件，但是本发明并不特别局限于这些条件。作为对杂交的严格性造成影响的要素，可考虑温度、盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员，就能够对这些要素进行适宜选择来实现最优的严格性。[0089]作为通过上述条件能够杂交的DNA，可举出与序列号25~31中的任一个所述的碱基序列的序列同源性是85%以上，优选90%以上，更优选95%以上的DNA，被编码的多肽只要具有氧化还原酶活性，就被包括在上述DNA中。[0090]此处，“序列同源性(％)”是由使被对比的两个DNA进行最优地比对排列，将核酸碱基(例如、A、T、C、G、U或I)在两个序列中一致的位置的数量用比较碱基的总数去除，然后将该结果乘以100而得到的数值表示。[0091]本发明的载体可以通过将本发明的DNA插入适当的载体而得到。用于插入DNA的空载体，只要在宿主细胞中能够进行自主复制，就无特别限制，可将质粒DNA或噬菌体DNA作为载体使用。例如，在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，可使用pBR322、pUC18、pBluescriptll等质粒DNA、EMBL3、M13、λgtll等噬菌体DNA等。在使用酵母作为宿主细胞的情况下，可使用YEpl3、YCp50等。在使用植物细胞作为宿主细胞的情况下，可使用pBI121、pBI101等，在使用动物细胞作为宿主细胞的情况下，可使用pcDNAI等作为载体。[0092]本发明的转化体可通过使用上述载体转化宿主细胞而得到。宿主生物，只要是能够由包含编码DNA的表达载体进行转化，将导入的DNA编码的蛋白质进行表达的生物，就无特别限制。作为能够利用的微生物，例如，可举出大肠埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)属、沙雷氏菌属(Serratia)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、链球菌属(Streptococcus)以及乳杆菌属(Lactobacillus)等宿主载体系统中被开发的细菌；红球菌属(Rhodococcus)以及链霉菌属(Streptomyces)等宿主载体系统中被开发的放线菌；酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)属、耶氏酵母属(Yarrowia)、丝抱酵母属(Trichosporon)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、毕赤酵母属(Pichia)以及假丝酵母属(Candida)等宿主载体系统中被开发的酵母；脉孢菌属(Neurospora)、曲霉属(Aspergillus)、头孢菌属(Cephalosporium)以及木霉属(Trichoderma)等宿主载体系统中被开发的霉菌等。此外，除了微生物以外，植物、动物中各种宿主.载体系统也正被开发，特别是在使用了蚕的昆虫或菜籽、玉米、土豆等植物中大量开发表达不同种类蛋白质的系统，能够合适地利用。其中，从导入以及表达效率的观点出发，优`选细菌，更优选大肠杆菌。[0093]作为转化的方法，向细菌导入重组体DNA的情况下，例如可举出使用钙离子的方法、电穿孔法等。作为向酵母的导入重组体DNA的方法，例如，可举出电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法等。作为向植物细胞导入重组体DNA的方法，可举出农杆菌(Agrobacterium)感染法、基因枪(particlegun)法、聚乙二醇法等。作为向动物细胞导入重组体DNA的方法，例如，可举出电穿孔法、磷酸钙法等。[0094]本发明的培养物可通过将上述转化体在培养基中培养而得到。将转化体在培养基中培养，使蛋白质在培养菌体中或培养上清中生成蓄积，采集前述酶突变体，从而能够得到包含本发明的蛋白质的培养物。[0095]转化体的培养，按照在宿主培养中使用的常规方法进行。作为培养以大肠杆菌等细菌为宿主而得到的转换细胞的培养基，可举出完全培养基或合成培养基，例如，可举出LB培养基、TB培养基、M9培养基等。此外，通过在培养温度20~40°C下进行有氧培养，使本发明的酶突变体在菌体内蓄积并进行回收。酶突变体的精制可通过如下方式进行，即，将通过前述的养法得到的培养物进行离心分离并回收，对细胞用超声波仪等进行破碎，将亲和色谱法、阳离子或阴离子交换色谱法、凝胶过滤等单独或适当组合，从而进行酶突变体的精制。得到的精制物质是目标酶的确认可通过常规方法，例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹法等进行。转化体的培养物的精制处理是指在不损失酶活性的情况下，将目标酶以外的杂质去除；精制处理物是通过前述处理而得到的含酶物。作为精制处理物，例如可举出通过破碎细胞而得到的无细胞提取液、精制得到的酶溶液、或者酶溶液的冷冻干燥物。[0096]将在具有醇脱氢酶活性的蛋白质导入选自上述(a)~(d)中至少一种的氨基酸置换突变而得到的蛋白质，与置换突变导入前的蛋白质相比较，对NADPH的依赖性提高，对NADH的依赖性降低。因此，使用该蛋白质，能够变换还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，得到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)。[0097]此外，由于该反应是平衡反应，因此使用该蛋白质，也能够变换氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，得到还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。[0098]将具有醇脱氢酶活性的蛋白质导入选自上述(i)~(1)中的至少一种的氨基酸置换突变而得到的蛋白质，与置换突变导入前的蛋白质相比较，对NADH的依赖性提高，对NADPH的依赖性降低。因此，使用本发明的蛋白质能够变换还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),得到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。[0099]此外，由于该反应是平衡反应，因此使用该蛋白质，也能够变换氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，得到还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。[0100]在本发明的蛋白质的反应系统中通过使辅酶再生系统共同作用，能够提高光学活性醇的生产率。[0101]使用本发明的蛋白质制造的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，通过与辅酶再生系统作用，能够制造还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。这样的辅酶再生系统是具有还原氧化型辅酶的活性的酶，作为具体例，可举出葡萄糖脱氢酶(GDH)、甲酸脱氢酶(FDH)、乳酸脱氢酶(LDH)以及苹果酸脱氢酶(MDH)。[0102]此外，使用本发明的蛋白质制造的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，通过使辅酶再生系统起作用，能够制造氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。这样的辅酶再生系统是具有将还原型辅酶进行氧化的活性的酶，作为具体例，可举出葡萄糖脱氢酶(GDH)、甲酸脱氢酶(FDH)、乳酸脱氢酶(LDH)以及苹果酸脱氢酶(MDH)。[0103]这些还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、或者氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的制造，可使用上述的转化体及其培养物进行。[0104]实施例[0105]关于置换氨基酸的突变的标记，进行如下标记:在置换位置的序号之前，附上野生型或非突变型的氨基酸，在置换位置序号之后，附上突变的氨基酸。例如，将201位的Asp置换为Ala的突变记为D201A。[0106](实施例1)包含RMA突变体基因的重组载体的制作以及重组大肠杆菌的制作[0107]为了使源自麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)的MDR(中链脱氢酶/还原酶)家族酶(国际公开第08/066018号小册子，以下简写为RMA)的突变体在大肠杆菌中表达，使用该文献中记载的PNCM载体(RMA野生型表达质粒)，制备各种突变体的表达质粒。[0108]关于突变的导入，将pNCM载体作为模板，通过使用以在意图的部位能够导入突变的方式而设计的2种合成引物的QuickChange法，得到包含各种RMA突变体基因的重组质粒。关于QuickChange法，使用QuickChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene公司制),按照添加的程序进行。首先，将pNCM(序列号9)作为模板DNA,应用使用序列号10~11所示的2种合成引物，实施QuickChange法,制备导入突变A206K的RMA突变