分子标记技术

分子标记技术分子标记简介

主要内容分子标记相关概念分子标记的类型与发展几种分子标记的应用一

分子标记相关概念

所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。1.广义的分子标记(molecularmarker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。分子标记的概念有广义和狭义之分2.狭义的分子标记概念只是指DNA标记

能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。

分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间的差异。

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分子标记发展简史

1.1869年，瑞士医生Miescher就开始了

核酸的研究。2.1930年提出两种核酸(RNA和DNA)的概

念。3.1953年Waston和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型之后，对基因的DNA序列及其表达和调控等方面的研究取得了很大进展。4.20世纪60年代中期,从细胞中分离基因的工作拉开了基因工程的序幕。5.60年代末和70年代初,主要致力于研究基因的体外分离技术。6.1980年Bostern将生物个体之间DNA序列的差异作为标记用于遗传作图，从此开创了在DNA水平上研究遗传变异的新阶段。7.近10年来，在人类基因组研究计划的推动下，分子标记的研究与应用得到迅速的发展。分子标记的历史第一代分子标记技术RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段长度多态性）第二代分子标记技术

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片断长度多态性）事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分子标记的SNP（单核苷酸多态性)

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分子标记来源于DNA水平的突变突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变，突变产生的变异是自然选择的基础，可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。多态性(Polymorphism)－群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。3

分子标记的特点

(相对形态，细胞，生化标记具有的优点)：

（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。理想的分子标记必须达以下要求：具有高的多态性共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型能明确辨别等位基因遍布整个基因组除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组选择中性(即无基因多效性)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)开发成本和使用成本尽量低廉在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求二类型及原理

现已出现的分子标记技术有几十种，部分分子标记技术所属类型如下：建立在Southern杂交基础上的分子标记技术限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)；染色体原位杂交(CISH)。以重复序列为基础的分子标记技术卫星DNA(SatelliteDNA)；小卫星DNA(MinisatelliteDNA)；简单序列重复SSR(SimpleSequenceRepeat)，即微卫星DNA。以PCR为基础的分子标记技术随机扩增多态性DNA(RAPD)；扩增片段长度多态性(AFLP)；单链构象多态性(SSCP)；cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP

)；靶位区域扩增多态性(TRAP)；序列特征化扩增区域(SCAR)；相关序列扩增多态性(SRAP)。以mRNA为基础的分子标记技术表达序列标签(ESTs)；差异显示(DD)；逆转录PCR(RT-PCR)；差异显示逆转录PCR(DDRT-PCR)；特征性差异分析(RAD)；基因表达系列分析(SAGE)。以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术

单核苷酸多态性标记(SNP)以特定序列为核心的分子标记技术

线粒体DNA分子标记(mtDNA)三.几种分子标记介绍

1.限制性片段长度多态性标记

RestrictionFragmentLengthPolymorphismRFLP：限制性片段长度多态性，为第一代多态性记。原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失，或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生，

那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，

就可以得到长短、数量、种类不同的限制性DNA片段，通过电泳和Southern杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,选用一定的DNA标记探针与之杂交，放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA限制性片段多态性图谱。RFLP原理：DNA限制性内切酶酶切电泳转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小RFLP的应用1.遗传学图的构建结合RFLP连锁图，任何能用RFLP探针检测出的基因及其DNA片段都可以通过回交，快速有效地进行转移。2.基因定位利用RFLP技术能够准确地标记定位种质中的目标基因，结合杂交，回交及组织培养等技术就可以快速有效的将所需目标基因的DNA片段引入栽培品种中，实现品种改良。

3.遗传多态性分析运用RFLP技术可以尽可能多地保存那些在已知位点上有异态的品系，以求最大程度地保持品种的多样性。4.细胞质遗传研究RFLP技术是对DNA序列自然变异的直接检测，只需选择适当的限制性内切酶或DNA探针作分子标记，因而对植物不同种属或杂种后的细胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较高的灵活性和灵敏性，从而能较好地应用于细胞质遗传的研究。限制性片段长度多态性(RFLP)优点标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响。RFLP标记的等位基因是共显性的，不受杂交的影响，可区分纯合基因与杂合基因。可产生的标记数目很多，可覆盖整个基因组。缺点标记技术需要酶切,对DNA质量要求高；RFLP

的多态性程度偏低；分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境

都有害；探针的制备、保存和发放也很不方便；分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。限制性片段长度多态性(RFLP)2.随意扩增多态性DNA标记—RAPDRandomAmplifiedPolymorphismicDNA概念：RAPD技术建立于PCR技术的基础之上，它是利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，这些引物在一定的退火条件下，

与基因组DNA中的互不顺序配对，通过DNA聚合酶的作用，能启动DNA的合成，扩增产物经过聚丙酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析，经EB染色或放射线自显影检测。这些扩增产物（DNA片段）的多态性可以反映基因组相应区域的多态性。原理：1.利用一个随机引物(一般为10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段；2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分离；3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录RAPD指纹；

4.进行DNA多态性分析。随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD技术流程：RAPD分子标记的应用RAPD技术已在苜蓿，豆类，番茄，辽东栎，蔗糖，丁香，葡萄，番木瓜，棉花，月季，牡丹，锦鸡儿，野大豆，桉树，玉米，水稻等多种植物中广泛应用。目前主要用于以下4个方面的研究：a：研究种质资源的亲缘关系和遗传背景。b：种质资源（含亲本材料）的分类。c：种质的遗传变异评价。d:核心种质筛选。基因连锁图的构建：Tulsieram等最早利用RAPD标记在胚乳组织进行白石杉的遗传学图构建，而后用相同的策略又相继构建了湿地松、欧洲赤松、火炬松等的遗传学图。新遗传资源的鉴定：李松涛等对抗锈病的两个小冰麦进行RAPD分析，从40个引物中筛选到一个与抗锈基因连锁的RAPD标记。分析结果有力地说明，小冰麦是从冰草获得抗锈基因的易位系。优点：技术简单，实验周期短，信息量大，检测速度快；DNA用量少；实验设备简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析；不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引物可以用于不同生物基因组分析；用一个引物就可扩增出许多片段，几乎覆盖整个基因组，而且不需要同位素，安全性好。随机扩增多态性DNA(RAPD)缺点：实验的稳定性和重复性差显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降；RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、Mg2+浓度，所以实验的重复性差。随机扩增多态性DNA(RAPD)3、简单重复序列标记—SSR

（simplesequenceRepeats）

简单序列重复(SSR)即微卫星DNA

微卫星是指以少数几个核苷酸(1~6个)为单位

多次串联重复的DNA序列。

微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。原理：由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成了每个位点的多态性。根据其两端的保守序列设计一对特异性引物，PCR扩增，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示不同基因型个体在这个SSR位点的多态性。简单序列重复(SSR)

SSR基本步骤：(1)构建小片段或大片段的基因组。(2)筛选阳性克隆。通过传统的影印或挑单菌落点膜的方法，把克隆转移到尼龙膜上，经过固定后，用标记过的序列重复寡核苷酸或含微卫星序列的探针与尼龙膜上的克隆点杂交，筛选出其中的阳性克隆。(3)测序、设计引物、优化PCR反应条件，获得的阳性克隆经过确认后，全部或经过随机挑选后测序，然后根据微卫星序列两侧保守区域的序列设计引物，优化PCR扩增的条件，获得稳定、可靠的SSR标记。应用是种群研究和进化生物学最常用的分子标记之一，广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图谱、种群遗传多样性、系统发生等研究领域。简单序列重复(SSR)微卫星标记的优缺点：

分布广泛、多态性丰富、杂合度高、通用性好以及扩增反应所需模板量少、重复性好，共显性遗传、检测方便、结果稳定。优点：缺点：SSR标记的建立首先要对为微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工合成设计引物以及标记的定位、作图等基础性究，因而其开发有一定的困难，费用也很高。

4.扩增片段长度多态性标记—AFLP

AmplifiedFragmentLengthPolymorphism

1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。定义由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。

AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。原理：AFLP是建立在基因组限制性片段基础上的PCR扩增。由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对摸板DNA进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检出多态性.AFLP技术路线1.基因组DNA被酶切成小片段：通常用一个四个碱基识别位点的限制性内切酶如MseI和一个六个碱基识别位点的酶如EcoRI，其中MseI确保产生合适大小的DNA片段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六个碱基识别位点酶EcoRI能够限制扩增片段数目，确保DNA多态性的正常检测；2.接头与酶切片段的连接：接头序列包括：一个核心序列和酶切位点特异序列，MSE接头和ECORI接头，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；3.预扩增：应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端为EcoRI切点，一端为MseI切点的DNA酶切片段，同时也与选择核甘酸配对的DNA序列才能被扩增。1～3步的产物可以通过Agarose胶检测。4.选择扩增：应用含有接头序列和三个选择核甘酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，进一步降低扩增片段数量，同时一个引物被同位素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片检测。优点

1）非常高的基因型分析效率；

2）不需要标记开发成本，但是需要优化特异引物及引物组合；

3）不需要基因组DNA序列信息；

4）AFLP分析只需要很少量的DNA；(typically0.2to2.5μgperindividual).5）AFLP可应用于任何生物。缺点1）需要高质量的DNA，以确保酶切完全；2）从单个多态性DNA片段开发位点特异性标记相当困难；3）多数情况下采用的是同位素标记；4）在染色体上不均匀分布，AFLP标记经常在着丝粒附近区域高度聚集AFLP标记技术的应用遗传连锁图谱的构建亲缘关系和遗传多样性的研究种质资源鉴定分子标记辅助选择育种基因表达和基因克隆SNP主要是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。也即SNP是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化。

主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换或颠换、以及单碱基的插入或缺失等。5.单核苷酸多态性标记(SNP)单核苷酸多态性标记(SNP)原理：

SNP与RFLP及SSR标记的不同有2个方面：其一，SNP不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记；其二，SNP

标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳，代之以最新的DNA

芯片技术。对成千上万个克隆测序，用计算机分析数据和显示最终结果。检测DNA芯片技术，最新报道的微芯片电泳(Microchipelectrophoresis)，可以高速度地检测临床样品的SNP。杂交型芯片将等位基因特异寡核苷酸共价固定在载体表面，用荧光标记引物扩增基因组DNA，再与芯片上的寡核苷酸杂交形成信号，并行读取芯片上不同SNP荧光信号，获得SNP信息。单核苷酸多态性标记(SNP)应用种群生物学特征、遗传性疾病检测、疾病关联分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因组作图和数量性状定位等方面也有越来越多的应用。单核苷酸多态性标记(SNP)优点

数量多，分布广泛，检测快速、

易于实现自动化，遗传稳定性高。缺点成本高，错误信号多。四作物育种中分子标记技术的应用

一、品种、品系鉴定和杂交种纯度分析

指纹图谱是鉴别品种、品系的有利工具，具有快速、准确等优点。在市场经济的条件下，指纹图谱在检测良种质量（真伪、纯度），防止伪劣种子流入市场，保护名、优、特种质及育成品种的知识产权和育种家的权益等方面有重要意义。在国外，指纹图谱用来鉴定作物品种的DUS（Distinctness，Unformity，Stability），为品种审定、保存、保护提供依据。

杂种优势利用正成为许多作物提高产量和改善品质的重要途径。对遗传差异与杂种优势关系的评价方法经历了从形态性状遗传距离，到生化标记遗传差异，亲缘系数，以及分子标记遗传差异等各种尝试。

杂种优势预测及机理研究DNA分子标记的应用，使得能够在整个基因组范围内对大量亲本材料间的遗传距离进行估测，并在此基础上有效地预测具有强优势的组合（Smith等，1992；Bernardo，1994）。结果：既有相关性很高的报道，又有完全相反的结果。分子标记杂合度与杂种优势的相关性因遗传材料而异，在经过改良的优良种质中，两者之间高度相关，而在一些未经改良的优良种质中，相关程度很低。提出了“上位性是杂种优势的主要遗传基础”的重要观点。应用cDNA－AFLP技术进行杂种优势机理的研究表明，强优势与弱优势组合间基因表达有明显差异，有增强型、减弱型和沉默型。杂种优势表现与单亲沉默、双单亲沉默有密切关系。大量研究表明，虽然分子标记揭示的遗传距离与杂种优势的关系比较复杂，但亲本之间的遗传差异是产生的主要原因。通过对与杂种优势相关QTLs效应的研究，可以加深对杂种优势机理的了解。二、亲缘关系分析

1.DNA标记所检测的是作物DNA水平的差异，因而非常稳定，在分子图谱帮助下对品种之间的比较可覆盖，大大提高了结果的可靠性。可用于品种资源的鉴定与保存，研究作物的起源与发展进化，杂交亲本的选择等。2.利用分子标记可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定亲本间遗传距离，指导杂交育种亲本选配，减少杂交组合数，有效划分杂种优势群，为提高育种效率提供依据。3.通过亲缘关系分析，可以纠正形态分类中一些不恰当的结论以及目前育种工作中存在的一些问题。孟祥栋通过对洋葱、胡葱、大葱的RAPD遗传分析，否定了“胡葱亲缘关系与大葱相近”的观点，而发现胡葱与洋葱亲缘关系较近，并推断胡葱可能是洋葱与大葱杂交后代逐渐进化而来的。大葱洋葱胡葱

三、基因标记及标记辅助育种（Marker-assistedSelection，MAS）

许多性状重要农艺性状表现为质量遗传特点，如抗病、抗虫、雄性不育、自交不亲和性等。质量性状虽然受少数主基因控制，但其中的许多性状仍受遗传背景、微效基因及环境因素影响，表现为数量性状特点。利用与目标性状紧密连锁的分子标记，是进行质量性状选择的有效途径。标记目标性状的方法主要有两个：

（一）Young等人提出近等基因系法（Near-isog