第4章 发酵工业的无菌技术课件

第4章发酵工业的无菌技术北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与工程系发酵工程第4章发酵工业的无菌技术4.1发酵工业的无菌处理灭菌

sterilization

用物理或化学方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程。适用于培养基等物料的无菌处理消毒

disinfection

用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。一般只能杀死营养细胞，而不能杀死芽孢和孢子，适用于发酵车间的环境和发酵设备、器具的无菌处理除菌

degerming

用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。防腐

antisepsis

用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。第4章发酵工业的无菌技术4.2发酵工业污染的防治策略

4.2.1污染的危害所谓“杂菌”，

是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。第4章发酵工业的无菌技术①发酵培养基因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。②杂菌合成一些新的代谢产物，或杂菌污染后改变了发酵液的某些理化性质，使发酵产物的提取和分离变得困难，造成产物收率降低或产品质量下降。③杂菌代谢会改变原反应体系的pH，使发酵发生异常变化。④杂菌分解产物，使生产失败。⑤细菌发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，导致整个发酵失败等。4.2发酵工业污染的防治策略

4.2.1污染的危害第4章发酵工业的无菌技术染菌对不同菌种发酵的影响青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大第4章发酵工业的无菌技术不同发酵时期染菌对发酵的影响①种子扩大时期染菌

菌体浓度低、培养基营养丰富。②发酵前期染菌

杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成。③发酵中期染菌

严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成。

④发酵后期染菌

如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐。

第4章发酵工业的无菌技术杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响①对过滤的影响

发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加大。造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。②对提取的影响

（1）有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开

（2）离子交换工艺：杂菌胶体物质易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量。

③对产品质量的影响

（1）对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。

（2）对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。第4章发酵工业的无菌技术不同染菌途径对发酵的影响

种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性

空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐

培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性

设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大

第4章发酵工业的无菌技术染菌对三废处理的影响

使过滤后的废菌体无法利用，发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间。发酵染菌的危害

（1）直接经济损失

（2）间接经济损失

第4章发酵工业的无菌技术4.2.2杂菌污染的防治

染菌的检查与类型的判断显微镜检查法平板划线培养检查法肉汤培养检查法发酵过程的异常现象观察法溶氧pH尾气CO2发酵气味、黏度、泡沫、颜色谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线.cn/07/wsw/kaifang06_7_2.htm

第4章发酵工业的无菌技术污染的原因分析种子带菌、空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误、技术管理不善…（1）从污染杂菌的种类进行分析

若污染的是耐热芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底；若污染的是球菌、无芽孢杆菌等不耐热菌，可能是种子带菌、空气除菌不彻底、设备渗漏等原因造成；若污染的是浅绿色菌落的杂菌，可能是冷却盘管渗漏引起；若污染的是霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或无菌操作问题引起；如污染的是酵母，则可能是由于糖液灭菌不彻底造成。第4章发酵工业的无菌技术污染的原因分析（2）从污染时间进行分析

若发酵前期染菌，可能是种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、接种操作不当或空气带菌等；若发酵后期染菌，可能是由于中间补料污染、设备渗漏或操作问题等引起。（3）从染菌的程度进行分析

如各个发酵罐或多数发酵罐染菌，而且污染的是同一杂菌，一般是空气系统存在问题。如果个别罐连续染菌，一般是某个设备的问题。第4章发酵工业的无菌技术染菌原因染菌率（%）染菌原因染菌率（%）种子带菌接种时罐压跌零培养基灭菌不透空气系统带菌泡沫冒顶夹套穿孔盘管穿孔9.640.190.7919.960.4812.365.89接种管穿孔阀门渗漏搅拌轴密封渗漏发酵罐盖漏其他设备渗漏操作问题原因不明0.391.452.091.5410.1310.1524.91染菌原因染菌率（%）染菌原因染菌率（%）外界带入杂菌（取样、补料等操作带入）设备穿孔空气系统带菌停电罐压跌零接种8.207.6026.001.6011.00蒸汽压力不够管理问题操作违反规程种子带菌原因不明0.607.091.600.6035.00表4.1某研究所对抗生素发酵染菌的原因分析表4.2某制药厂链霉素发酵染菌原因分析第4章发酵工业的无菌技术杂菌污染的途径及其预防（1）种子带菌及其防治①培养基及器具彻底灭菌②避免菌种在移接过程中受污染③避免菌种在培养过程或保藏过程中受杂菌污染（2）过滤空气带菌及其防治①正确选择采气口，提高采气口，加装前置粗过滤器…②更加发酵工厂所在地区的气候条件，设计合理的空气预处理流程，防止空气冷却器渗漏，勿使冷却水进入空气处理系统…③设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质第4章发酵工业的无菌技术杂菌污染的途径及其预防（3）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治①发酵罐的“死角”②管道安装不当或配置不合理形成的“死角”第4章发酵工业的无菌技术杂菌污染的途径及其预防（4）培养基灭菌不彻底导致染菌及其防治①原料性状的影响②灭菌时温度与压力不对应造成染菌③灭菌过程中产生的泡沫造成染菌④连续灭菌维持时间不够或压力波动大而造成染菌⑤灭菌后期的罐压骤变造成染菌（5）操作不当造成染菌接种时，罐压跌零；泡沫顶盖。。。（6）噬菌体染菌及其防治第4章发酵工业的无菌技术4.3发酵工业的无菌技术

干热灭菌法湿热灭菌法（蒸汽的强穿透能力，及冷凝时释放大量潜热）121℃，30min射线灭菌法化学药剂灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法（仅适用于金属或玻璃小用具，接种时常用火圈）第4章发酵工业的无菌技术4.4发酵培养基及设备管道灭菌

4.4.1湿热灭菌原理

致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需时间。微生物的热阻：微生物对热的抵抗力，即微生物在某一特定条件下（主要是温度）的致死时间。相对热阻：某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。微生物名称大肠杆菌细菌芽孢霉菌孢子病毒相对热阻13×1062~101~5表4.3某些微生物对湿热的相对热阻第4章发酵工业的无菌技术湿热灭菌的对数残留定律一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速率理论，微生物受热死亡的速率式中N—残留活菌数，个

t—受热时间，mink—比死亡速率常数，min-1，也称灭菌速率常数，与微生物的种类及灭菌温度有关（4-1）第4章发酵工业的无菌技术

若开始灭菌（t=0）时，培养基中活的微生物数为N0，将式（4-1）积分后可得到式中N0—开始灭菌时原有的活菌数，个；

Nt—经过t时间灭菌后的残留菌数，个。（4-2）（4-3）第4章发酵工业的无菌技术

实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120℃时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。TimeNt/N0嗜热脂肪芽孢杆菌热死亡曲线第4章发酵工业的无菌技术影响培养基灭菌的其他因素污染菌的种类、数量、灭菌温度和时间…培养基成分培养基pH培养基的物理状态泡沫培养基中的微生物数量第4章发酵工业的无菌技术4.4.2分批灭菌

将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。不需专门的灭菌设备，投资少，设备简单，灭菌效果可靠。对蒸汽的要求较低，一般在（3~4)×105Pa(表压)就可满足要求，分批灭菌是中小型发酵罐常用的一种灭菌方法。包括升温、保温、降温三个过程第4章发酵工业的无菌技术4.4.3连续灭菌

将配制好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作过程。可在短时间内加热到保温温度，并能很快被冷却，可在比分批灭菌更高的温度下灭菌，而保温时间则很短，有利于减少营养物质的破坏，提高发酵产率。在连续灭菌时，发酵罐应在连续灭菌前先进行空罐灭菌，以容纳经过灭菌的培养基。加热器、维持罐和冷却器也应先进行灭菌。第4章发酵工业的无菌技术冷却塔第4章发酵工业的无菌技术连续灭菌设备的结构

是培养液高温短时间连续灭菌设备，它与维持罐组成连续灭菌系统，分套管式和汽液混合式两类。套管式连消塔汽液混合式连消塔第4章发酵工业的无菌技术喷射加热器可使料液和蒸汽迅速接触，充分混合，加热是在瞬时内完成的。生料加热料蒸汽第4章发酵工业的无菌技术维持罐灭菌系统中的维持设备，主要是使加热后的培养基在维持设备中保温一段时间，以达到灭菌的目的，也称保温设备。第4章发酵工业的无菌技术薄板换热器第4章发酵工业的无菌技术4.4.4发酵培养基及设备管道灭菌技术①种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147MPa，维持45min，灭菌过程中，从所有液位以上的阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过这些阀门以防出现死角。灭菌完毕后关闭蒸汽，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气以保压0.098MPa。②空气总过滤器和分过滤器灭菌

排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上下口排蒸汽，维持压力0.147MPa灭菌2h。灭菌完毕后，通入压缩空气吹干。第4章发酵工业的无菌技术4.4.4发酵培养基及设备管道灭菌技术③种子培养基实罐灭菌从夹层通入蒸汽间接加热至80℃，再从取样管、进风管、接种管等液面以下的阀门通入蒸汽，进行直接加热。同时关闭夹层蒸汽进口阀门、升温至121℃，维持30min。④发酵培养基实罐灭菌从夹层或盘管式换热器进入蒸汽，间接加热至90℃，关闭夹层及盘管蒸汽，从取样管、进风管、放料管等液面以下的阀门通入蒸汽，直接加热至121℃，维持30min。第4章发酵工业的无菌技术4.4.4发酵培养基及设备管道灭菌技术⑤发酵培养基连续灭菌

一般培养基的连续灭菌采用灭菌温度130℃，维持5min。⑥补料实罐灭菌根据料液不同而异，淀粉料液为121℃，维持5~10min。尿素溶液灭菌为105℃，维持5min。第4章发酵工业的无菌技术4.5空气除菌提高除菌效率的主要措施：①减少进口空气的含菌数量②设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质③针对不同地区，设计合理的空气预处理