DB2306T 185-2023牛呼吸道疾病综合征病原PCR检测技术规范

2306 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定楠楠，阙桃林，倪宏波，闻晓波，张晓轩，侯喜林牛呼吸道疾病综合征病原PCR检测技术规范本文件规定了牛呼吸道疾病综合征病原PCR检测技术的环境与设施、仪器设备、试剂与材料、样本GB/T18637牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术GB/T27981牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T3234牛支原体PCR检测方法SN/T1129牛病毒性腹泻/粘膜4环境与设施具有与采集病料相适应的动物病原微生物实验室条件和生物安全防护水平相适应的设备，以及防4.2操作人员资质及防护要求生物安全柜、4℃离心机、PCR仪、漩涡震荡器、水平电泳仪、凝胶成像系细菌总DNA提取试剂盒、PBS溶液、TrizolReage6.2材料200μL、1000μL）等。离心管（1.5mL、2mL），），），R7.2核酸提取上游引物：5ˊ-CACGGACCTGGTGGACAAGAAG-3ˊ下游引物：5ˊ-CTACCGTCACGTGAGTGGTACG-3扩增体系：上、下游引物各50pM，脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP反应条件：共进行35个循环；每个温度循环由95℃60s、57℃60s和72℃60s组成。最后1用IBRV特异性引物对分离培养物和IBRV标准株准株均能扩增出与目的基因片段大小一致的特异性条带，扩增结果清晰，无杂带，则为上游引物：5ˊ-TGTGGACCTAAACCTCACGGT-3ˊ(57499–下游引物：5ˊ-GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC-3ˊ(探针序列：5ˊ-FAM-AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC-TAMRA-3ˊ(57525–5通常根据所选择的设备分析软件说明设定阈值，来自阴性动物病毒分离阴性样本，用做检测系统的背景信号。每次检测反应应该包括阴性对照、阳性对照和试剂对照。来自阴性牛的肺组织或者值应该在可接受的范围内(±3Ct值），为了尽量减少阳性对照造成的污染风险，应采用稀释使CT值阴性结果：未检测出Ct值的样本应判定为阴性。阴性对照和未添加模板应检测不出C8.2牛病毒性腹泻病毒根据BVDV病毒株基因序列5ˊUTR设计合成一对特异性引物上游引物：5ˊ-AGGCTAGCCATGCC2如被检样品有条带，大小为244bp，与阳性样品相同，即可判定为阳性。上游引物：5ˊ-CCGCGAMGGCCGA下游引物：5ˊ-TGACGACTNCCC探针序列：5ˊ-FAM-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-BH）；核酸，判为阳性；Ct（或Cp）值>35，且出现典型的扩增曲线的样品需复检。复检仍出现上述结果的，8.3.2逆转录-实时荧光定量（RT-q探针序列：5ˊ-FAM-TTGCGCTTGCACC-M通常根据所选择的设备分析软件说明设定阈值，来自阴性动物病毒分离阴性样本，用做检测系统根据Ct（或Cp）值对试验结果进行描述及判定，描述和判定分为：无Ct（或Cp）值，且线，表示样品中无BPIV3核酸，判为阴性；Ct（或Cp）值<35，且出现典型的扩增曲线在BPIV3核酸，判为阳性；Ct（或Cp）值>35，且出现典型的扩增曲线的样品需复检。复检仍），8.4.2逆转录-实时荧光定量PCR（RT-q根据Ct（或Cp）值对试验结果进行描述及判定，描述和判定分为：无Ct（或Cp）值，且线，表示样品中无BRSV核酸，判为阴性；当Ct（或Cp）值<35，且出现典型的扩增曲线，表示样存在BRSV核酸，判为阳性；Ct（或Cp）值>35，且出现典型的扩增曲线的样品需复检。复检仍出上游引物：5ˊ-GACGAGCTCTTAGCAGTCGCAGCAGTA-3ˊ下游引物：5ˊ-GGGGTCGACTTAGACATTGCCTTTTGTTGTTACG-3ˊ上游引物：5ˊ-GGGGCTTTTTGTTTTGGTGG-3ˊ(70-8.7.1聚合酶链反应（PCR）检测，遵上游引物：5ˊ-TTTTAGCTCTTTTTGAA扩增基因片段长度1.9kb。扩增体系：上、下游引物（10µM）各0.5µL，5U/μLrTaqDNA聚合酶0.5µL，25反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环；最后72℃取PCR产物经EB染色的0.8%琼脂糖凝胶进行电泳和成像。待检样品扩增出的DNA片段为1.9kb，可判定为支原体核酸阳性；未出现1.9kb的DNA片段，则摇动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5moL/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。直接灭菌PBS缓冲液（0