抗体工程制药

关于抗体工程制药第一节概述第2页,共104页，2024年2月25日，星期天一、基本概念1、抗体（antibody，Ab）指机体的免疫细胞被抗原激活后，由B淋巴细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。

即能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。第3页,共104页，2024年2月25日，星期天2、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig

）具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白。因结构不同可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE5种。

免疫球蛋白是结构及化学的概念，而抗体是生物学及功能的概念。

第4页,共104页，2024年2月25日，星期天3、抗原（antigen，Ag）一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物(抗体)在体内外发生特异性结合的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是反应原性。

第5页,共104页，2024年2月25日，星期天抗原的分类

完全抗原（completeantigen）

简称抗原。是一类既有免疫原性，又有反应性性的物质。如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是完全抗原。不完全抗原

即半抗原，是只具有免疫反应性，而无免疫原性的物质。如：多糖、青霉素、磺胺剂和花粉等。半抗原与蛋白质载体结合后，就获得了免疫原性。第6页,共104页，2024年2月25日，星期天4、抗原表位（epitope）指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。

又称为抗原决定簇。第7页,共104页，2024年2月25日，星期天抗体工程制药

（antibodyengineeringpharmaceutics）是指利用基因工程、细胞工程和转基因动植物技术生产抗体药物的过程。第8页,共104页，2024年2月25日，星期天抗体药物的应用

治疗肿瘤目前在临床中使用的肿瘤治疗药物多数存在“敌我不分”的问题，即在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了人体正常细胞。“生物导弹”为解决这个难题提供了一个理想的思路。“生物导弹”，即将各种毒素、放射性同位素、化疗药物与识别肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的抗体偶联后，能够特异杀伤肿瘤细胞的一类药物。这种药物经由静脉注入人体内，药效分子集中作用于肿瘤细胞，既增强疗效又减少对机体的毒副作用。放射性同位素与抗体的偶联物在体内能将前者运至药靶部位，并通过其放射性活性杀伤靶细胞。第9页,共104页，2024年2月25日，星期天逆转器官移植排斥进行器官移植时，可以采用某些抗体类药物来逆转器官移植引起的排斥反应。如最早批准（1986年）进入美国市场的治疗性抗体类药物——抗CD3单抗即被用于肾、心脏、肝脏移植排斥的逆转。

第10页,共104页，2024年2月25日，星期天目前正在进行开发和已经投入市场的抗体药物主要有以下几种用途：

1．器官移植排斥反应的逆转；

2．肿瘤免疫诊断；

3．肿瘤免疫显像；

4．肿瘤导向治疗；

5．哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病；

6．抗独特型抗体作为分子瘤苗治疗肿瘤；第11页,共104页，2024年2月25日，星期天抗体工程的发展1937年用电泳法将血清分为白蛋白、甲种、乙种、丙种球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年，kohler和milstein首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体，得以规模化制备特异性、均质性抗体。通过基因工程技术制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体等。第12页,共104页，2024年2月25日，星期天抗体技术发展经历的三个阶段：第一代：抗血清多克隆抗体第二代：70年代中期，利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备的杂交瘤单克隆抗体（McAb）第三代：基因工程抗体。第13页,共104页，2024年2月25日，星期天多克隆抗体

(polyclonalantibody,pAb)天然抗原分子中常含有多种抗原决定簇，以该物质刺激机体，体内多个B淋巴细胞被激活，产生的抗体实际上含有针对多种不同抗原表位的抗体，是多克隆抗体；1、抗血清第14页,共104页，2024年2月25日，星期天动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。多克隆抗体的产生过程当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成浆细胞，大量的浆细胞合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。第15页,共104页，2024年2月25日，星期天获得多抗的途径：动物免疫血清恢复期患者血清免疫接种人群血清第16页,共104页，2024年2月25日，星期天动物抗血清的优缺点从动物血清提取抗体主要克服了人血浆来源有限造成的制约。然而，动物来源产品均存在潜在的危险，如过敏和传播感染性病原体等。多抗体异性不高，易发生交叉反应。第17页,共104页，2024年2月25日，星期天

解决单抗特异性不高的理想方法是针对单一表位的特异性抗体-单克隆抗体。第18页,共104页，2024年2月25日，星期天2、单克隆抗体（monoclonalantibody，mAb

）

第19页,共104页，2024年2月25日，星期天如果能选出一个浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体（mAb）。单克隆抗体的概念第20页,共104页，2024年2月25日，星期天问题：浆细胞在体外寿命短，难以培养和扩增，怎么办？第21页,共104页，2024年2月25日，星期天解决办法

1975年，kohler和milstein将以下两种细胞融合：B细胞：能产生抗体，但寿命短骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞第22页,共104页，2024年2月25日，星期天mAb制备过程第23页,共104页，2024年2月25日，星期天每个杂交瘤细胞由一个B细胞与一个骨髓瘤细胞融合，仅合成和分泌抗单一抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。优点：结构单一，特异性强，交叉反应少。第24页,共104页，2024年2月25日，星期天问题从动物脾脏B细胞获得的单克隆抗体（即鼠源性抗体）对人具有较强的免疫原性，会产生人抗鼠抗体（HAMA)。对单克隆抗体进行改造，产生了基因工程抗体。第25页,共104页，2024年2月25日，星期天3、基因工程抗体

（geneticallyengineeredantibodies，gAb）是通过基因工程技术获得抗体，即通过PCR技术获得抗体基因，与载体重组后，引入表达系统后，表达产生的抗体。优点：即保持了单抗的均一性、特异性强的优点，又能克服其作为鼠源性抗体的不足。第26页,共104页，2024年2月25日，星期天简言之，基因工程抗体就是将人源抗体的编码基因克隆到真核或原核表达系统中，体外表达人源化抗体其根本出发点是解决抗体的鼠源性问题。

第27页,共104页，2024年2月25日，星期天第二节

抗体分子的结构和功能第28页,共104页，2024年2月25日，星期天二、抗体的结构第29页,共104页，2024年2月25日，星期天（一）基本结构第30页,共104页，2024年2月25日，星期天1.轻链（lightchain，L链）由214个氨基酸残基组成，相对分子量25kD，同一抗体分子上2条L链总是相同。第31页,共104页，2024年2月25日，星期天2.重链（heavychain，H链）由450~570个氨基酸组成，相对分子量约50~70kD。每条H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽，为球形。第32页,共104页，2024年2月25日，星期天3.可变区（V区）和恒定区（C区）V区：近N-端轻链的1/2区段、重链的1/4或1/5区段的氨基酸组成及排列顺序多变，分为VL和VH。C区：近C-端轻链的1/2区段、重链的3/4或4/5区段的氨基酸组成较恒定,分为CH1、CH2、CH3。

第33页,共104页，2024年2月25日，星期天可变区是指此区域内的氨基酸序列在不同的抗体中不同。恒定区是指此区域内的氨基酸序列在不同的抗体中相同。第34页,共104页，2024年2月25日，星期天4.超变区（HVR区）和骨架区（FR）HVR：可变区中，某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性。它们共同组成抗原结合部位，该部位在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补。也称为互补决定区（complementary-determiningregion，CDR），分别称为CDR1，CDR2，CDR3。

FR：可变区中氨基酸残基变化小的部分，维持空间结构。第35页,共104页，2024年2月25日，星期天5.铰链区（hingeregion）CH1和CH2之间的区域。含大量脯氨酸，具有弹性，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于与抗原表位间的互补性结合。

第36页,共104页，2024年2月25日，星期天（二）功能区1.抗体的功能区由一条多肽链折叠而成的球形结构域称为功能区。每个功能区约由110个氨基酸组成，具有不同生物学功能。

第37页,共104页，2024年2月25日，星期天2.各功能区的功能VH和VL共同构成抗原特异性结合部位。补体结合位点借助CH2通过胎盘屏障第38页,共104页，2024年2月25日，星期天（三）水解片段Ig分子中有些部位在一定条件下，容易被蛋白酶水解为各种片段。常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。Ig酶解的片段获得，大大促进了Ig分子结构和功能的研究，同时也为各种基因工程抗体的构建打下了基础。如DNA操作和抗体改型技术的发展，使得人们可根据抗体水解片段的结构和功能关系，产生更多有功能的Ig改型分子片段

第39页,共104页，2024年2月25日，星期天1.木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶水解Ig分子可产生2个抗原结合片段（fragmentofantigen-binding，Fab）、一个可结晶片段（fragmentcrystalizable，Fc）。Fc片段相当于两条重链的CH2和CH3功能区，由二硫键连接，可形成结晶，其无抗原结合活性，但具有固定补体、结合Fc受体等功能。Fab片段包括完整的轻链和部分重链（VH和CH1），能与一个抗原特异性结合，具有单价抗体活性。可通过基因工程获得Fab片段。第40页,共104页，2024年2月25日，星期天2.胃蛋白酶水解Ig分子可产生1个F（ab’）2、若干个裂解的小分子片段（pFc’）。

F（ab’）2含有两条L链和略大于Fab段的H链，由二硫键连接，具有双价抗体活性。第41页,共104页，2024年2月25日，星期天四、抗体的功能（一）V区的功能识别并结合抗原（二）C区的功能激活补体系统介导免疫细胞活性穿过胎盘和粘膜第42页,共104页，2024年2月25日，星期天第三节单克隆抗体的制备第43页,共104页，2024年2月25日，星期天主要分为以下几个步骤：抗原的制备动物的免疫抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞杂交瘤细胞的选择性培养与筛选大量制备单克隆抗体第44页,共104页，2024年2月25日，星期天一、单克隆抗体技术的基本原理B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。

第45页,共104页，2024年2月25日，星期天两类细胞融合物中存在以下细胞：未融合的单核亲本细胞（脾、瘤细胞）同型融合多核细胞（脾-脾、瘤-瘤融合细胞）异型融合双核细胞（脾-瘤融合细胞）第46页,共104页，2024年2月25日，星期天杂交瘤细胞的筛选使用HAT（H为次黄嘌呤、A为氨基蝶呤、T为胸腺嘧啶核苷）培养基。

第47页,共104页，2024年2月25日，星期天HAT筛选杂交瘤细胞的原理哺乳动物细胞中，DNA前体物的合成有两种不同的途径：

从头合成途径：可被氨基蝶呤阻断

补救合成途径：需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶（TK)存在。骨髓瘤细胞株：从头合成途径被A阻断；是HGPRT缺陷（HGPRT-)和TK缺陷（TK-),不能利用培养基中的H和T完成DNA的合成而死亡。第48页,共104页，2024年2月25日，星期天二、抗原和免疫（一）抗原的制备1.提取纯化天然抗原运用蛋白质等分离纯化技术分离蛋白质分子作为抗原。对于含量低的蛋白分离纯化成本高，目前已少用。第49页,共104页，2024年2月25日，星期天2.用基因工程技术制备重组蛋白抗原可获得足够数量蛋白抗原。原核系统只能提供连续氨基酸表位的抗原。真核及哺乳动物细胞系统可解决抗原构象表位，但产量低，成本过高。第50页,共104页，2024年2月25日，星期天3.合成多肽半抗原根据抗原蛋白的氨基酸序列，经人工合成抗原表位的多肽片段，即多肽半抗原。该方法效率高、成本低，已成为抗原制备的主要来源。

半抗原：只有反应原性而无免疫原性的物质。其可与抗体或致敏淋巴细胞特异性结合，但不能单独诱发免疫应答。第51页,共104页，2024年2月25日，星期天小分子半抗原抗生素（青霉素等）、农药、重金属等属于小分子半抗原。多肽半抗原及小分子半抗原与载体偶联载体如牛血清清蛋白（BSA)等。第52页,共104页，2024年2月25日，星期天（二）动物及免疫免疫接种的目的是使B细胞在特异性抗原刺激下分化、增殖、分泌特异性抗体。1.动物的选择一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。常用的骨髓瘤品系来自Balb/c小鼠和Lou大鼠，免疫动物也采用相应品系。Balb/c小鼠第53页,共104页，2024年2月25日，星期天2.免疫方法有体内、体外和脾内免疫法。体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多。第54页,共104页，2024年2月25日，星期天体外免疫

体外免疫是指在一定条件下，在体外将正常脾细胞与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。

第55页,共104页，2024年2月25日，星期天体外免疫方法分离小鼠脾细胞或淋巴细胞，RPMI1640培养液中，加适量滋养细胞与抗原，37度5％CO2培养3天。体外免疫方案免疫效果不如其它方案，仅用于抗原量极少，抗原免疫原性弱的抗原。用于不能采用体内免疫法的情况。第56页,共104页，2024年2月25日，星期天脾内免疫

小鼠麻醉后，打开腹腔，沿脾脏长轴方向缓慢注入0.1-0.2ml可溶性抗原，免疫后3～4d即可取脾细胞进行融合。

目前最常用的是体内免疫法。第57页,共104页，2024年2月25日，星期天3.乳化为增强免疫原性，常加入佐剂（弗氏佐剂）。初次免疫时，抗原需要与一定量弗氏完全佐剂混合，经乳化后应用。加强免疫时，可以用不完全佐剂，或不用佐剂。第58页,共104页，2024年2月25日，星期天弗氏完全佐剂

由油剂（石蜡油或植物油）、乳化剂（羊毛脂或吐温（Tween）80）灭活的分枝杆菌（卡介苗）组成。

有比较强烈的刺激免疫系统，被免疫系统认为是外界物质的作用。能刺激免疫系统产生应答。

第59页,共104页，2024年2月25日，星期天弗氏不完全佐剂

只有石蜡油和羊毛脂，缺少灭活的结核菌的弗氏佐剂。

弗氏完全佐剂用于初次免疫刺激。弗氏不完全佐剂用于加强免疫。第60页,共104页，2024年2月25日，星期天乳化用佐剂将抗原包裹使之形成油包水乳剂。乳化方法有：乳钵研磨、机械搅拌等。第61页,共104页，2024年2月25日，星期天4.体内免疫途径皮下、腹腔和静脉注射等（抗原量多）。皮下、皮内和足掌等多点注射（抗原量少）。体内免疫后药物吸收进入血液。第62页,共104页，2024年2月25日，星期天5.免疫程序初次免疫（Ag100-500ug加弗氏完全佐剂注射）第二次免疫（剂量同上，加弗氏不完全佐剂注射）加强免疫（融合前免疫）无菌取脾，制备脾细胞第三次免疫（剂量同上，加弗氏不完全佐剂注射）4周后4周后5-7天采血，检测抗体效价，2周后3天后第63页,共104页，2024年2月25日，星期天三、细胞融合和杂交瘤细胞的选择细胞融合（cellfusion）是2个或2个以上的细胞合并成一个细胞的过程。免疫动物的脾细胞

+骨髓瘤细胞=杂交瘤细胞。所需要的细胞：免疫动物的脾细胞、骨髓瘤细胞、饲养细胞。第64页,共104页，2024年2月25日，星期天（一）细胞的准备1.

免疫脾细胞指处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞。取加强免疫以后3天的脾脏制备B淋巴母细胞。此时，脾脏体积是正常鼠脾脏体积的2倍，B淋巴母细胞比例较大，融合成功率较高。第65页,共104页，2024年2月25日，星期天免疫脾细胞制备操作步骤小鼠最后一次加强免疫3天后，摘除眼球取血断颈处死，浸泡于75%酒精消毒无菌剪刀分离脾脏脾脏用RPMI培养液洗涤一次，制成细胞悬液晒网过滤，细胞计数离心，弃上清培养液重悬，冰水浴中备用第66页,共104页，2024年2月25日，星期天2.骨髓瘤细胞融合前两周开始复苏。培养基RPMI1640、DMEM均可作为其培养基，小牛血清的浓度一般在10~20%,1:10传代稀释。活细胞计数高于95%，以保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。第67页,共104页，2024年2月25日，星期天3.饲养细胞（feedercell）加入的目的在于促进细胞生长繁殖。能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性，能释放某些生长刺激因子。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。第68页,共104页，2024年2月25日，星期天小鼠腹腔巨噬细胞制备操作步骤（融合前2-3天制备）Balb/c小鼠断颈处死，浸泡于75%酒精消毒无菌剪刀剪开腹腔，暴露腹膜无菌注射器注入腹腔培养液8-12ml反复冲洗，吸出冲洗液离心，弃上清培养液重悬，加入96孔板，37度，CO2孵箱培养备用第69页,共104页，2024年2月25日，星期天（二）脾细胞和骨髓瘤细胞的融合取适量脾细胞和骨髓瘤细胞（3:1~5:1）进行混合，在聚乙二醇作用下诱导融合，2min左右。PEG浓度越高，促融率越大，但毒性也越大。常用浓度40~50%，分子量4kD。常用方法有转动法和离心法。第70页,共104页，2024年2月25日，星期天细胞融合流程图将脾细胞和骨髓瘤细胞在离心管中混合培养液洗1次，离心，弃上清吸尽残留液体，37℃水浴，加入细胞融合剂加入不完全培养液，终止融合剂的作用离心，弃上清用含20％小牛血清RPMI1640（含HAT）融合后细胞悬液加入96孔板，孵箱培养第71页,共104页，2024年2月25日，星期天（三）HAT选择杂交瘤细胞在HAT培养基中，次日即可观察到骨髓瘤细胞相继死亡。融合后3-4天可在镜下观察到细胞克隆的形成。第72页,共104页，2024年2月25日，星期天四、筛选阳性克隆及克隆化筛选阳性克隆（screening）：即筛选能分泌特异性单抗的杂交瘤细胞。方法：是用抗原分别检测杂交瘤细胞中分泌的抗体，常用的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA)、放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）等。第73页,共104页，2024年2月25日，星期天ELISA法的原理其基本方法是将已知的抗体或抗原吸附在固相载体表面。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。第74页,共104页，2024年2月25日，星期天ELISA实验流程示图

第75页,共104页，2024年2月25日，星期天酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如：用酶免疫测定法测定口蹄疫抗体，其敏感度可达0.1ng/ml。第76页,共104页，2024年2月25日，星期天操作程序①加抗体包被→4℃过夜，洗涤三次、抛干②加待检抗原→37℃30分钟，洗涤三次、抛干③加酶标抗体→37℃30分钟，洗涤三次、抛干④加底物液→37℃15分钟，加终止液⑤用ELISA检测仪测定OD值。

第77页,共104页，2024年2月25日，星期天酶标板

酶标板(ELISAPLATE):在酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)中,作为载体的固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面对抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附也起着重要作用。酶标板根据其孔数可以分为48孔，96孔。一般常用的为96孔。

酶标仪即酶联免疫检测仪,是酶联免疫吸附试验的专用仪器.其工作原理基本上都是一致的,其核心都是一个比色计,即用比色法来分析抗原或抗体的含量.

酶标仪第78页,共104页，2024年2月25日，星期天（二）杂交瘤细胞的克隆（cloning）是指将阳性孔中分泌抗体的单个细胞分离出来。方法：克隆化的原则：对于检测阳性的杂交瘤细胞应尽早克隆化。

有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，每孔一个细胞。第79页,共104页，2024年2月25日，星期天（三）杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞是很有必要的。细胞冻存液：50%小牛血清，40%不完全培养液和10%DMSO。方法：室温降到0℃，再降到-70℃，转入液氮中。第80页,共104页，2024年2月25日，星期天六、单克隆抗体的大量制备体内培养法

利用活体动物作为生物反应器，将杂交瘤细胞注射到小鼠或大鼠的腹腔内生长并分泌单抗。

方法是：腹腔注射杂交瘤细胞，7~10天后抽取腹水，离心，得上清液。第81页,共104页，2024年2月25日，星期天降植烷

降植烷是一种免疫抑制剂。所以，提前一周注射降植烷、液体石蜡等免疫抑制剂，总的来说是为了提高单克隆抗体产生的效率。第82页,共104页，2024年2月25日，星期天体外培养法

体外使用旋转培养容器培养杂交瘤细胞，从细胞培养上清液中获得抗体。该方法获得的抗体产量较体内培养法低。第83页,共104页，2024年2月25日，星期天七、单克隆抗体的纯化澄清和沉淀处理：离心沉淀，过滤，蛋白沉淀。分离纯化：层析技术。第84页,共104页，2024年2月25日，星期天第四节基因工程抗体第85页,共104页，2024年2月25日，星期天单克隆抗体的缺点绝大多数来源于小鼠或大鼠。人体使用鼠抗体会产生人抗鼠抗体，产生超敏反应。解决办法制备人源性抗体，但人-人杂交瘤技术未实现突破。第86页,共104页，2024年2月25日，星期天基因工程抗体制备抗体基因，与载体连接后导入受体细胞，表达抗体。第87页,共104页，2024年2月25日，星期天基因工程抗体包括抗体抗体片段抗体偶联物抗体融合蛋白等第88页,共104页，2024年2月25日，星期天一、Fab与FvFab抗体片段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成。第89页,共104页，2024年2月25日，星期天Fv抗体片段由一个VH和一个VL组成。通过非共价键结合组成，是抗体中具有完整抗原结合活性的最小功能片段。分子片段小，免疫原性弱，对实体瘤的穿透性强。Fv可作为靶向载体药物、毒素等结合，用于肿瘤的治疗。第90页,共104页，2024年2月25日，星期天二硫键稳定的Fv（disulfide-stablized，dsFv）由一个VH和一个VL组成。是在VH和一个VL

的适当位置各引入一个半胱氨酸，形成dsFv

。二硫键远离CDRs互补决定区，不会影响与抗原的结合。第91页,共104页，2024年2月25日，星期天二、单链抗体（SinglechainFv

，ScFv）是利用DNA重组技术将抗体的一条VH和VL基因，通过一条短肽链(一般为15个氨基酸)连接后表达出来的抗体片段。第92页,共104页，2024年2月25日，星期天单链抗体的优点是:只含有V区，不含Fc段，不与非靶细胞结合，可作为药物的导向载体。分子小，容易进入组织(包括肿瘤),因而可用于肿瘤的诊断和治疗;因其为单链,易于进行分子改造,如与毒素等拼接成为免疫毒素,可以直接杀伤靶细胞;可由大肠杆菌等发酵,进行大批量生产，优于完整抗体。第93页,共104页，2024年2月25日，星期天3.单链抗体在肿瘤治疗中的应用

构建和生产免疫毒素（immunotoxin）免疫毒素：抗体与毒素的偶联物可将毒素定位于靶细胞，对靶细胞进行特异性杀伤。是将单链抗体基因C末端与毒素基因相连，经表达后获得scFv与毒素的融合蛋白。常用的毒素有绿脓杆菌外毒素PE、蓖麻毒素、白喉毒素等。将抗表皮生长因子的单链抗体EGF与PE40偶联，获得的重组毒素已用于膀胱癌病人