沉淀法和吸附法

关于沉淀法和吸附法(一)盐析法(二)有机溶剂沉淀法(三)等电点沉淀法(四)生成盐复合物沉淀法一、沉淀法第2页,共44页，2024年2月25日，星期天一、沉淀法沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质由液相转变为固相析出的过程。成本低设备简单收率高浓缩倍数高操作简单优点：第3页,共44页，2024年2月25日，星期天①盐析法:多用于分离纯化各种蛋白质和酶。②有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸等产品的分离纯化，也有用于蛋白质的沉淀。③等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀。④生成盐复合物沉淀法：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。第4页,共44页，2024年2月25日，星期天(一)盐析法

高浓度的中性盐能破坏蛋白质、酶等的胶体性质，中和微粒上的电荷，促使蛋白质等发生沉淀或絮凝现象。logS＝β-Ks•Ⅰ

S—离子强度为Ⅰ时的蛋白质的溶解度；

Ks—盐析常数，与温度和pH无关；

β值—是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大小主要取决于不同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和pH值有关，但与盐的种类无关;为便于计算，用盐的摩尔数m代替离子强度I，则

logS＝β-Ks•m1、盐析原理第5页,共44页，2024年2月25日，星期天盐析机理示意图

第6页,共44页，2024年2月25日，星期天第7页,共44页，2024年2月25日，星期天第8页,共44页，2024年2月25日，星期天盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。第9页,共44页，2024年2月25日，星期天碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图pH6.6，温度25℃，logS0=17g·L-1第10页,共44页，2024年2月25日，星期天不同蛋白质的溶解度曲线第11页,共44页，2024年2月25日，星期天蛋白质的盐析分布曲线第12页,共44页，2024年2月25日，星期天溶解度曲线(a)和盐析分布曲线(b)

第13页,共44页，2024年2月25日，星期天蛋白质起始浓度的影响高浓度蛋白质溶液可以减少盐的用量，但蛋白质浓度太高，会发生严重的共沉作用。2、影响盐析的主要因素第14页,共44页，2024年2月25日，星期天无机盐种类的影响不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃）

(○)NaCl;(▼)KCl;(◘)MgSO4;(▲)NH4SO4;(●)Na2SO4;(□)K2SO4;(■)柠檬酸三钠离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。不同蛋白质盐析所需离子强度不同。可用不同的盐浓度将各种蛋白质分别沉淀析出。第15页,共44页，2024年2月25日，星期天温度的影响升温，可增加许多无机盐和小分子有机物的溶解度。但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小。第16页,共44页，2024年2月25日，星期天pH对β的影响盐析pH的选择要以不降低产物的活性为原则。由于蛋白质在等电点时最易沉淀，可选择等电点的pH作为盐析的pH第17页,共44页，2024年2月25日，星期天二次盐析第18页,共44页，2024年2月25日，星期天第19页,共44页，2024年2月25日，星期天(二)等电点沉淀法

是利用两性电解质在电中性时溶解度最低的原理，进行物质分离纯化的方法。中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的pH值向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。等电点沉淀法应在低离子强度下操作。许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内。第20页,共44页，2024年2月25日，星期天(二)等电点沉淀法是利用两性电解质在电中性时溶解度最低的原理进行物质分离纯化的方法。中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的pH值向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。等电点沉淀法应在低离子强度下操作。许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内。第21页,共44页，2024年2月25日，星期天许多无机酸的价格低廉，并能为食品标准允许。缺点：优点：酸化时，容易引起蛋白质失活，因为蛋白质对低pH比较敏感。第22页,共44页，2024年2月25日，星期天等电点沉淀实例从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。第23页,共44页，2024年2月25日，星期天等电点沉淀实例碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。

第24页,共44页，2024年2月25日，星期天(三)有机溶剂沉淀法许多水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。其主要作用是降低水溶液的介电常数。1、有机溶剂沉淀的原理第25页,共44页，2024年2月25日，星期天有机溶剂沉淀原理图第26页,共44页，2024年2月25日，星期天分辨能力比盐析法高一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀沉淀不需脱盐有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，因此适用于食品、药品的制备。优点：第27页,共44页，2024年2月25日，星期天容易引起蛋白质变性失活有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高需冷却、降温、低温操作。缺点：对同一种溶剂，蛋白质的分子质量越大，沉淀所需有机溶剂的量越少。第28页,共44页，2024年2月25日，星期天2、影响有机溶剂沉淀的因素有机溶剂的种类：选择的溶剂必须能与水互溶，但与产物如蛋白质等不发生反应。温度：降低温度可以增加收率。同时许多生物分子如蛋白质、核酸等对温度特别敏感，温度稍有升高，便发生变性。pH：选择溶解度最低时的pH，有助于提高沉淀效果。因此在接近等电点处，以引起沉淀所需有机溶剂的量较少。合适的pH也可大大提高分离的分辨能力。第29页,共44页，2024年2月25日，星期天样品浓度和分子质量：低浓度样品需用有机溶剂的量较大，但共沉作用小，有利于提高分离的效果；但低浓度样品损失较大，回收率低，具有生理活性的样品容易产生稀释变性。金属离子和离子强度：Mn2+、Fe2+、Co2+、Zn2+等阳离子能与蛋白质中的羧基、氨基和含有氮杂环的化合物结合，形成难溶复合物，有利于沉淀。但离子强度过大，不利分离。第30页,共44页，2024年2月25日，星期天3、有机溶剂沉淀实例第31页,共44页，2024年2月25日，星期天（四）生成盐复合物沉淀——柠檬酸钙盐沉淀1、提取过程的化学反应：

2C6H8O7•H2O+3CaCO3→Ca3(C6H5O7)2•4H2O+3CO2↑+H2OCa3(C6H5O7)2•4H2O+3H2SO4+4H2O→2C6H8O7•H2O+3CaSO4•2H2O第32页,共44页，2024年2月25日，星期天1、工艺流程：第33页,共44页，2024年2月25日，星期天3、中和与酸解中和：滤液中除含柠檬酸外，还含可溶性的残糖以及蛋白质、金属离子等杂质。利用柠檬酸钙难溶于水的特点，与杂质分离的过程。酸解：中和所得钙盐经过滤、洗涤，与硫酸反应生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，过滤，滤液含较纯的柠檬酸。第34页,共44页，2024年2月25日，星期天4、生产设备及操作调浆：调浆罐，30—50%浓度；中和：中和罐，滤液、钙浆泵入，搅拌，

70-90℃，控制终点；过滤：过滤槽、带式过滤机，90℃热水逆流洗涤；酸解：酸解罐，搅拌，稀酸调浆，加热，加硫酸，控制终点；过滤：过滤槽、带式过滤机，90℃热水逆流洗涤，至pH大于4。第35页,共44页，2024年2月25日，星期天(一)吸附过程的基础理论(二)吸附类型(三)影响吸附过程的因素二、吸附法第36页,共44页，2024年2月25日，星期天

选择性吸附法用于：分离精制各种产品、空气的净化、除菌、脱色、除热源、去组胺等杂质。吸附作用：物质从流体相(气体或液体)浓缩到固体表面的过程。吸附剂：在表面上能够发生吸附作用的固体。吸附物：被吸附的物质。(一)吸附过程的基础理论不同固体物质的表面自由能不同，所以对其他物质的吸附能力不同，表面自由能越高，吸附能力越强。第37页,共44页，2024年2月25日，星期天

吸附作用力也是范德华力。它是一组分子引力的总称，包括三种力，即定向力、诱导力和色散力。定向力：是极性分子之间产生的作用力，是极性分子间的静电引力，分子的极性越大，力也越大。诱导力：指极性分子和非极性分子之间的吸引力，极性分子产生的电场作用会诱导非极性分子极化，两者之间相互吸引而发生吸附作用。这种力与温度无关。第38页,共44页，2024年2月25日，星期天色散力：是非极性分子之间的引力，当分子外围电子运动及原子核在零点附近震动，正负电荷中心出现瞬时相对位移时，产生快速变化的瞬时偶极矩，能使外围非极性分子极化，反过来又影响瞬时偶极矩的变化而产生这种色散力。与温度无关。此外，还有氢键力，这是介于库仑引力和范德华力之间的定向力，比诱导力和色散力都大。第39页,共44页，2024年2月25日，星期天(二)吸附类型1、物理吸附：

吸附剂和吸附物通过分子间的引力产生的吸附。特点：吸附作用不仅局限于活性中心，而是整个自由界面；分子被吸附后，一般动能降低，所以吸附是放热反应；物理吸附的吸附热较小，