免疫血清学检验技术

关于免疫血清学检验技术凝集反应：细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象。一、凝集反应及其特点第一节凝集与沉淀反应第2页,共105页，2024年2月25日，星期天凝集反应过程：抗原抗体的特异性结合出现肉眼可见的凝集现象凝集反应特点：IgM的作用比IgG大数百倍IgG与抗原结合后，常不出现凝集现象，称不完全抗体临床意义：进行细菌的抗原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查未知血清的抗体。第3页,共105页，2024年2月25日，星期天多克隆抗体单克隆抗体肌红蛋白上清液第4页,共105页，2024年2月25日，星期天肉眼可见的凝集现象第5页,共105页，2024年2月25日，星期天直接凝集反应(directagglutination)：

颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。二、直接凝集反应第6页,共105页，2024年2月25日，星期天（一）玻片凝集试验YYY+

方法评价:定性试验简便和快速敏感度低临床应用:菌种鉴定血清学分型血型鉴定第7页,共105页，2024年2月25日，星期天（二）试管凝集试验方法评价：半定量试验简便、快速敏感度低可有假阳性临床应用：肥达氏试验：伤寒副伤寒外裴二氏试验：斑疹伤寒Wrighttest:布鲁菌病交叉配血试验第8页,共105页，2024年2月25日，星期天间接凝集反应(indirectagglutination)：

将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。载体种类：RBC（醛化）；聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化）；金黄色葡萄球菌。三、间接凝集反应第9页,共105页，2024年2月25日，星期天用抗原致敏载体--检测抗体（一）间接凝集反应的类型1、正向间接凝集试验第10页,共105页，2024年2月25日，星期天用抗体致敏载体----检测抗原2、反向间接凝集试验第11页,共105页，2024年2月25日，星期天用抗原致敏载体--检测抗原3、间接凝集抑制试验第12页,共105页，2024年2月25日，星期天coagglutinationtest：以金黄色葡萄球菌菌体为反应的载体。人及多种哺乳动物（猪、兔、豚鼠等）血清中IgG抗体的FC段与菌体表面的A蛋白（SPA）非特异性结合后，IgG的两个Fab段仍然暴露在菌体表面，保持着结合抗原的活性和特异性。当与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象。SPA--(Fc)IgG(Fab)--AbSPA：staphylococcalproteinA4、协同凝集试验第13页,共105页，2024年2月25日，星期天（二）正向间接血凝试验血凝试验强度第14页,共105页，2024年2月25日，星期天1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024Pos.Neg.Titer648512<232128324Patient12345678正向间接血凝试验第15页,共105页，2024年2月25日，星期天（三）反向胶乳凝集试验第16页,共105页，2024年2月25日，星期天将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用时，若血清含有抗病毒抗体则可形成肉眼可见的粉红色凝集（四）明胶凝集试验第17页,共105页，2024年2月25日，星期天抗原的检测反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。抗体的检测检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体。（五）间接凝集反应的应用第18页,共105页，2024年2月25日，星期天未经致敏的受检者新鲜红细胞试剂：抗人O型红细胞的单克隆抗体临床应用：HIV检测、HBV检测四、自身红细胞凝集试验第19页,共105页，2024年2月25日，星期天五、抗球蛋白试验（Coombs试验）第20页,共105页，2024年2月25日，星期天（一）直接Coombs试验检测红细胞上的不完全抗体第21页,共105页，2024年2月25日，星期天（二）间接Coombs试验检测血清中的不完全抗体第22页,共105页，2024年2月25日，星期天可溶性抗原(如细菌、外毒素、血清蛋白等)与相应抗体特异性结合后，在一定条件(适量的电解质、合适的酸碱度和温度)下，经一定时间，于比例合适处形成肉眼可见的沉淀现象。六、沉淀反应precipitationreaction第23页,共105页，2024年2月25日，星期天沉淀反应液体内沉淀反应凝胶沉淀反应环状沉淀反应絮状沉淀反应免疫浊度测定琼脂扩散试验免疫电泳双向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验对流免疫电泳试验第24页,共105页，2024年2月25日，星期天（一）单向琼脂扩散试验制成含有适宜抗体浓度的琼脂凝胶板。以适当距离打孔，孔中加入可溶性抗原。抗原向周围扩散，当抗原与抗体比例适宜时，在琼脂中形成抗原－抗体复合物的晶格和沉淀。沉淀环的直径与抗原浓度呈正相关。扩散圈出现呈两重沉淀环的双环现象，表明存在但抗原性相同，而扩散率不同的两种组分。第25页,共105页，2024年2月25日，星期天大分子抗原和长时间扩散（＞48h）：C=k×d2小分子抗原和较短时间（24h）：logC=k×d第26页,共105页，2024年2月25日，星期天（二）双向琼脂扩散试验可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周扩散，若两者分子比例适当，则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线。第27页,共105页，2024年2月25日，星期天第28页,共105页，2024年2月25日，星期天加入定量的抗体在中间孔，按一定距离在四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原可见粗细不等的沉淀线，从而可判定抗原的效价。第29页,共105页，2024年2月25日，星期天三孔型双向免疫扩散可能的结果第30页,共105页，2024年2月25日，星期天（三）对流免疫电泳试验概念:

在电场中进行的双向免疫扩散。原理:

将抗原加至近阴极孔内，抗体加至近阳极孔内。抗原与抗体在pH8.6的缓冲液中均带负电荷，通电后，抗原因带负电荷向阳极泳动，而抗体球蛋白等电点高，所带负电荷少，加之分子量较大，向阳极的位移小于受电渗作用向阴极的位移，形成抗原抗体相向移动。二者结合，在比例适宜处形成白色沉淀线。优点:

快速，只需1小时左右；灵敏度提高，约为10μg／ml。第31页,共105页，2024年2月25日，星期天第32页,共105页，2024年2月25日，星期天（四）火箭电泳RocketElectrophoresis

又称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。第33页,共105页，2024年2月25日，星期天火箭电泳示意图第34页,共105页，2024年2月25日，星期天早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析。第二节放射免疫测定技术第35页,共105页，2024年2月25日，星期天常用标记核素

125I3H射线类型γβ理化性活泼不活拨核素丰度>90%-半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂第36页,共105页，2024年2月25日，星期天一、放射免疫分析1、基本原理：Ab限量，Ag*定量，Ag*与Ag具有等同的与Ab结合能力，且两者的总量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低，二者变化成函数关系。第37页,共105页，2024年2月25日，星期天第38页,共105页，2024年2月25日，星期天以未结合的Ag*为F，Ag*-Ab复合物为B，则B/F或B/T(B＋F)与Ag的量变存在着剂量-反应曲线。第39页,共105页，2024年2月25日，星期天2、实验方法及测定Ag*Ag平衡非平衡一步法二步法Ab＋体积温度时间pHAg*--标准；Ag--样品第40页,共105页，2024年2月25日，星期天二抗体沉淀法

PEG沉淀法PR试剂法活性炭吸附法分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响操作应简单、重复性好经济结合与游离标记物的分离第41页,共105页，2024年2月25日，星期天二、免疫放射分析1、基本原理：以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。第42页,共105页，2024年2月25日，星期天2、单位点IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合游离的标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量第43页,共105页，2024年2月25日，星期天3、双位点IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。第44页,共105页，2024年2月25日，星期天RIAIRMA标记物抗原抗体原理竞争性结合非竞争结合反应体系Ag*、Ag、Ab固相Ab、Ab*、Ag反应动力学慢快灵敏度相对低高检测范围窄宽1-2数量级特异性差（PcAb）优（McAb）标准曲线结合率与测值成反比结合率与测值成正比待测抗原大小分子二抗原决定簇IRMA与RIA比较第45页,共105页，2024年2月25日，星期天

将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。第三节荧光免疫技术（一）荧光免疫分析的基本原理第46页,共105页，2024年2月25日，星期天均相荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定非均相荧光免疫测定荧光偏振免疫测定荧光免疫技术荧光免疫技术的类型荧光免疫测定液体样品测定荧光抗体技术固体样品测定直接法间接法双标记法第47页,共105页，2024年2月25日，星期天荧光物质λex（nm）λem（nm）应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495520～530（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575595～600（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550620（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560595（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354430（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340613时间分辨荧光免疫测定荧光免疫测定中常用的荧光物质第48页,共105页，2024年2月25日，星期天时间分辨检测原理示意图（二）时间分辨荧光免疫测定1、基本原理第49页,共105页，2024年2月25日，星期天镧系元素铕(Eu3+)（最常用）；钐(Sm3+)；铽(Tb3+)；钕(Nd3+)；镝(Dy3+)荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA10002、标记物常见荧光物质的荧光寿命第50页,共105页，2024年2月25日，星期天3、信号增强作用结合β-二酮体Eu3+解离pH<4荧光增强Eu3+标记的抗原-抗体复合物固相双抗体夹心法原理示意图第51页,共105页，2024年2月25日，星期天固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物在酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。4、双抗体夹心法第52页,共105页，2024年2月25日，星期天待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。5、固相抗体竞争法第53页,共105页，2024年2月25日，星期天待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。6、固相抗原竞争法第54页,共105页，2024年2月25日，星期天荧光偏振免疫测定原理示意图（三）荧光偏振免疫测定第55页,共105页，2024年2月25日，星期天荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图

酶标记抗体或抗原，与固相载体包被的抗原或抗体特异性结合。洗去游离的酶标物。加入底物，经酶分解后生成荧光产物。（四）荧光酶免疫测定第56页,共105页，2024年2月25日，星期天标记酶底物荧光产物λex(nm)λem(nm)响应信号碱性磷酸酶4-MUP4-MU36045010β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根过氧化物酶HPA二聚体3174140.03荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物第57页,共105页，2024年2月25日，星期天固相抗体和酶标记抗体与待检抗原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。1、双抗体夹心法第58页,共105页，2024年2月25日，星期天荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图第59页,共105页，2024年2月25日，星期天固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。2、双抗原夹心法第60页,共105页，2024年2月25日，星期天待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。3、固相抗原竞争法第61页,共105页，2024年2月25日，星期天抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)（五）荧光酶免疫技术的应用1、自身抗体检测第62页,共105页，2024年2月25日，星期天寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)2、病原体检测第63页,共105页，2024年2月25日，星期天肿瘤（人肝癌细胞）3、免疫病理检测第64页,共105页，2024年2月25日，星期天4、细胞表面抗原和受体检测荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。第65页,共105页，2024年2月25日，星期天酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析第四节酶免疫测定一、基本原理第66页,共105页，2024年2月25日，星期天（一）常用的酶及其底物1、辣根过氧化物酶（HRP）多用于ELISA方法。四甲基联苯胺TMB。反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性。2、碱性磷酸酶（AP）对-硝基苯磷酸酯（pNPP）。经酶作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。3、β-半乳糖苷酶（β-Gal）多用于均相酶免疫测定。4MUG。经酶作用后生成高强度荧光物，用荧光计测量。第67页,共105页，2024年2月25日，星期天（二）固相载体及其处理1、常用的固相载体塑料制品、微颗粒、膜载体。通过固相载体可以方便的将非均相酶免技术中游离的和结合的抗体（或抗原）酶标记物迅速分离。第68页,共105页，2024年2月25日，星期天2、固相载体的处理⑴包被（coating）：将抗原或抗体结合于固相载体。⑵封闭（blocking）：用1%-5%的牛血清白蛋白或5%-20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。第69页,共105页，2024年2月25日，星期天酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位液体标本中抗原或抗体的定性和定量（三）酶免疫技术分类第70页,共105页，2024年2月25日，星期天均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛。常用于传染病的诊断：病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒；结核杆菌、幽门螺杆菌。也用于一些蛋白质的检测：各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原）。（三）酶免疫测定的应用第71页,共105页，2024年2月25日，星期天

酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。常用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定。二、均相酶免疫测定第72页,共105页，2024年2月25日，星期天1、酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

第73页,共105页，2024年2月25日，星期天2、克隆酶供体免疫分析CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

第74页,共105页，2024年2月25日，星期天三、酶联免疫吸附试验Enzyme-linkedimmunosorbentassay（一）基本过程及试剂1、包被：固相的抗原或抗体2、反应：加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。酶标记物（酶结合物）3、洗涤：使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离4、底物显色：定性或定量的分析。酶反应的底物第75页,共105页，2024年2月25日，星期天1、双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色

应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等（二）ELISA检测抗原的方法第76页,共105页，2024年2月25日，星期天第77页,共105页，2024年2月25日，星期天双抗体夹心法测抗原YYYEYEYEYYEYEYEYYYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYYYY第78页,共105页，2024年2月25日，星期天2、竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）第79页,共105页，2024年2月25日，星期天第80页,共105页，2024年2月25日，星期天竞争法测抗原YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYEYE第81页,共105页，2024年2月25日，星期天1、间接法方法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点：一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。应用：常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。（三）ELISA检测抗体的方法第82页,共105页，2024年2月25日，星期天第83页,共105页，2024年2月25日，星期天间接法测抗体YEYYYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEYEY第84页,共105页，2024年2月25日，星期天2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体第85页,共105页，2024年2月25日，星期天3、竞争法原理：类似检测抗原的竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测第86页,共105页，2024年2月25日，星期天应用于病原体急性感染诊断中的IgM型抗体、甲型肝炎HAV-IgM抗体、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体的检测。原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

4、捕获法第87页,共105页，2024年2月25日，星期天第88页,共105页，2024年2月25日，星期天捕获法原理EYEYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY第89页,共105页，2024年2月25日，星期天第五节固相膜免疫测定一、常用的固相膜及其特点玻璃纤维素(fiberglass)，尼龙(nylon)，聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)，硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)多孔性--毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原--高度敏感性易于漂洗--操作简便第90页,共105页，2024年2月25日，星期天固相NC膜第91页,共105页，2024年2月25日，星期天

利用金溶胶中金颗粒高电子密度的特性，使其与抗体结合。显微镜下，金标蛋白结合处可见黑褐色颗