免疫组化讲课原理及方法

关于免疫组化讲课原理及方法免疫组织化学技术的原理及其方法一.基本知识二.基本原理三.方法四.结果的判断及异常着色原因分析和对策第2页,共73页，2024年2月25日，星期天一、免疫组化技术的基本知识第3页,共73页，2024年2月25日，星期天一、免疫组化技术的基本知识免疫组化的基本概念

利用抗原-抗体特异性结合原理检测抗原或抗体一般是用抗体检测抗原抗原

两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具有抗原性抗体

与抗原能特异性结合—生物学结合是免疫球蛋白Ig第4页,共73页，2024年2月25日，星期天免疫球蛋白的化学结构及其模式图

免疫球蛋白根据重链结构命名

IgG(γ),IgA(α)，IgD(δ),IgE(ε),IgM(μ)

五种免疫球蛋白只有两种类型的轻连，即：

Kappa(κ)和Lambda(λ)

每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子决不可能既有κ链又有λ链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。第5页,共73页，2024年2月25日，星期天免疫球蛋白的化学结构及其模式图Fc(Fragmentcrystalline)

是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片段，因其纯化时呈结晶状态而名之，该片段与抗原特异性有关

Fab(Fragmentantigenbingding)

该端是抗体与抗原特异性结合的部位，每分子Ig能结合2个抗原分子

FcFabAg第6页,共73页，2024年2月25日，星期天多克隆抗体与单克隆抗体及其产生

多克隆抗体：多株B细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单株淋巴细胞（克隆）所产生的抗体多克隆抗体单克隆抗体第7页,共73页，2024年2月25日，星期天多克隆抗体与单克隆抗体及其产生多克隆抗体的产生以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录上常以RaH（RabbitagainstHuman）表之。多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。第8页,共73页，2024年2月25日，星期天多克隆抗体与单克隆抗体及其产生

单克隆抗体的产生

应用细胞融合的杂交瘤技术（Hybridization），以针对单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性B细胞）融合形成杂交瘤，其特点是既能产生特异性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外培养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人（抗原）的抗体常以MaH表示，现在亦有兔的单克隆抗体第9页,共73页，2024年2月25日，星期天免疫小鼠Mouse第10页,共73页，2024年2月25日，星期天抗原的制备：传统用蛋白提纯近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因结构，用其合成多肽，作为抗原，如ER、PR抗原的制备现有兔的单抗第11页,共73页，2024年2月25日，星期天多克隆抗体和多克隆抗体的选用单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感性高，为何使用完全决定于使用的目的性第12页,共73页，2024年2月25日，星期天市售抗体的种类某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋白酶有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。如Desmin来源于鸡的肌肉近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性第13页,共73页，2024年2月25日，星期天标记抗体在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶金属离子：胶体金颗粒标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低第14页,共73页，2024年2月25日，星期天酶—抗酶抗体复合物通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的免疫复合物。如PAP复合物（PeroxidaseAntiPeroxidaseComplex），PAP复合物属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。第15页,共73页，2024年2月25日，星期天亲和素—生物素复合物

（Avidin-BiotinComplexABC）亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性AB复合物多用于ABC法的免疫组化中第16页,共73页，2024年2月25日，星期天

酶标亲和素（Labelledstreptavidin）在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感第17页,共73页，2024年2月25日，星期天多聚物载体一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKOEPOS及DAKOEnvision试剂核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物第18页,共73页，2024年2月25日，星期天一步法：EPOStissueantigen

dextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule

第19页,共73页，2024年2月25日，星期天二步法：EnVision第20页,共73页，2024年2月25日，星期天葡萄球菌蛋白A（StaphylococcalproteinA,SPA）第21页,共73页，2024年2月25日，星期天二、免疫过氧化物酶染色技术的基本原理第22页,共73页，2024年2月25日，星期天免疫过氧化酶染色技术的基本原理第23页,共73页，2024年2月25日，星期天识别系统特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性抗体具有识别并结合靶抗原的功能，这是本技术的理论依据所在特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有单抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完成第24页,共73页，2024年2月25日，星期天显示系统也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显示系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗原的存在及其定位显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在标记位点形成有色分子的终末产物，若显色剂为DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀

E(酶)+S(底物)

E·S(酶底物复合物)

P(反应产物)

+E(酶)

循环使用第25页,共73页，2024年2月25日，星期天显示系统辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程:HRP+H2O2

HRP·H2O2

有色分子终末产物+HRP

DAB（电子供体）

HRP：酶

H2O2：底物

HRP·H2O2：酶·底物复合物

第26页,共73页，2024年2月25日，星期天免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色系统的差异：间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶PAP法：利用PAP复合物ABC法：利用AB复合物LSAB法:利用直接标记于亲和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体

其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性显示系统第27页,共73页，2024年2月25日，星期天联结系统联结或桥联抗体（一般为第二抗体）按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统一体应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多克隆还是单克隆：若一抗是多克隆抗体，则二抗是羊或其它动物的抗兔血清；若一抗是单克隆抗体，则二抗常是兔抗鼠的血清有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗第28页,共73页，2024年2月25日，星期天三、免疫组化染色方法的类别第29页,共73页，2024年2月25日，星期天免疫组化染色方法的类别直接法间接法PAP法ABC法LSAB法一步法（EPOS）两步法（Envision）第30页,共73页，2024年2月25日，星期天直接法将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。优点：特异性高、非特异染色轻。缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记第31页,共73页，2024年2月25日，星期天第32页,共73页，2024年2月25日，星期天间接法将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺点：特异性差第33页,共73页，2024年2月25日，星期天PrimaryAntibodySecondaryAntibodySubstrate-chromogenesolution第34页,共73页，2024年2月25日，星期天PAP法

（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）组成：一抗是针对靶抗原的特异性抗体二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP）第35页,共73页，2024年2月25日，星期天PAP法

（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）优点：PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色可用于福尔马林固定的石蜡切片第36页,共73页，2024年2月25日，星期天PAPPrimaryAntibodySecondaryAntibodyPeroxidase-anti-PeroxidaseSubstrate-chromogenesolution第37页,共73页，2024年2月25日，星期天ABC法

（Avidin-BiotinComplex，亲和素-生物素法）组成：一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素）优点：亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。能用于常规石蜡切片。第38页,共73页，2024年2月25日，星期天亲和素—生物素复合物

（Avidin-BiotinComplexABC）亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性AB复合物多用于ABC法的免疫组化中第39页,共73页，2024年2月25日，星期天ABC法

（Avidin-BiotinComplex，亲和素-生物素法）第40页,共73页，2024年2月25日，星期天一抗二抗ABCDABABC第41页,共73页，2024年2月25日，星期天ABC与PAP法的比较第42页,共73页，2024年2月25日，星期天LSAB（SP）法

（labelledstreptavidinbiotinmethod）标记的链霉亲和素-生物素法特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上优点：更快速：空间结构更小更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结第43页,共73页，2024年2月25日，星期天

酶标亲和素（Labelledstreptavidin）在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感第44页,共73页，2024年2月25日，星期天SPPrimaryAntibodyBiotinylatedSecondaryAntibodyEnsyme-conjugatedStreptavidinSubstrate-chromogensolution第45页,共73页，2024年2月25日，星期天ABC与LSAB(SP)法的比较第46页,共73页，2024年2月25日，星期天一步法（EPOS）及两步法（Envision）特点以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）优点操作简便，省时提高了敏感性和特异性减少了背景着色避免内源性生物素的干扰第47页,共73页，2024年2月25日，星期天多聚物载体一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKOEPOS及DAKOEnvision试剂核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物第48页,共73页，2024年2月25日，星期天一步法：EPOStissueantigen

dextranbackboneprimaryantibodyenzymemolecule

第49页,共73页，2024年2月25日，星期天二步法：EnVision第50页,共73页，2024年2月25日，星期天一步法（EPOS）及两步法（Envision）比较第51页,共73页，2024年2月25日，星期天Substrate-chromogensolutionEPOS一步法第52页,共73页，2024年2月25日，星期天PrimaryAntibodyPolymercomplexSubstrate-chromogensolutionEnVision二步法第53页,共73页，2024年2月25日，星期天四、免疫组化染色结果的判断及异常着色的原因分析及其对策第54页,共73页，2024年2月25日，星期天特异性着色具备特点

特定的组织特定的定位特定的细胞特定的细胞内的部位分布上的不均一着色的不均一性着色强度的不均一颗粒性显色：DAB显色剂应为棕黄到棕褐色免疫组化染色结果的判断第55页,共73页，2024年2月25日，星期天CK染色，结肠腺癌细胞膜特异性着色第56页,共73页，2024年2月25日，星期天Kappa胞浆着色第57页,共73页，2024年2月25日，星期天TdT染色，胞核着色第58页,共73页，2024年2月25日，星期天PR胞核着色第59页,共73页，2024年2月25日，星期天ER胞核着色第60页,共73页，2024年2月25日，星期天免疫组化染色结果的判断对照的设置空白对照阳性对照吸收试验对照替代对照自身对照第61页,共73页，2024年2月25日，星期天异常着色（假阳性）原因及对策异常着色原因内源酶及内源性生物素抗体本身原因切片制作不当冲洗不充分DAB显色产生背景着色抗原的丢失抗原的遮蔽抗体试剂因素操作不当假阴性的原因第62页,共73页，2024年2月25日，星期天内源酶及内源生物素非特异性着色原因及对策灭活过氧化物酶-----3%H2O2灭活内源性生物素----蛋清封闭或更换不含生物素的染色系统灭活碱性磷酸酶Desmin第6