尿激酶原的研究概况

关于尿激酶原的研究概况一、前言

尿激酶原（Pro-urokinase,Pro-UK）

单链尿激酶型纤溶酶原激活剂

(Single-ChainUrokinase-typePlasminogenActivtor)

尿型纤溶酶原激活剂

(Urinary-typeplasminogenactivtor)

第2页,共62页，2024年2月25日，星期天二、尿激酶原的研究历史1973年Bernik从组织培养液中发现尿激酶原。1970年代末到1980年代初人们先后从新鲜人尿、人和动物的正常细胞、肿瘤细胞中纯化出单链尿激酶并命名为尿激酶原。1980年代中期开始，欧美日等发达国家用基因重组技术克隆表达尿激酶原的工程菌或工程细胞株纯化制备尿激酶原。第3页,共62页，2024年2月25日，星期天1985国际血栓形成和止血委员会正式命名尿激酶原为单链尿激酶型纤溶酶原激活剂。1986欧美开始小规模的临床研究，到1994年以后开始大规模的临床试验，德国用大肠杆菌表达的尿激酶原(Saruplase)先后完成了6775例心肌梗塞病人的临床试验。1994美国Abotte公司研制的尿激酶原(Prolyse)

做了400多例心肌梗塞和脑梗塞病人的临床试验，现正在做第Ⅲ期临床试验。第4页,共62页，2024年2月25日，星期天三、国内研究概况〝七五〞期间，北京大学、南京大学和军事医学科学院生物工程研究所开始研究重组人尿激酶原，都得到国家科技部〝863〞委员会的资助。我所率先获得全长人尿酶原基因cDNA克隆，接着又构建出高产工程细胞株。并于〝八五〞中期和〝九五〞期间完成了重组尿激酶原的中试工艺研究和临床前安全评价，于2001年完成Ⅰ期临床试验。第5页,共62页，2024年2月25日，星期天五、pro-UK的化学结构

pro-UK由411个氨基酸残基组成的单链多肽（简称pro-UK），分子量约为49KD左右，在302位天冬酰胺残基有一个糖链，分子量约2320Da，由岩藻糖、甘露糖、半乳糖和N-乙酰-葡萄糖胺组成，在第18位苏氨酸残基上有一个糖基

岩藻糖，分子量180Da。其一级结构如下图所示：第6页,共62页，2024年2月25日，星期天尿激酶原的结构第7页,共62页，2024年2月25日，星期天

Pro-UK属于丝氨酸蛋白酶类，分子内有12对二硫键。pro-UK分子按结构功能可分为四个结构域，依次为：

（1）表皮生长因子结构域(第5-49位氨基酸残基），与表皮生长因子高度同源，其功能与促进pro-UK的生物合成有关，该区有三对二硫键，即在11与19、13与31、33与42氨基酸残基之间各有一对二硫键；

（2）Kringle（指环）结构域（第50-136位氨基酸残基），其功能与血小板蛋白和细胞膜蛋白结合有关，该区也有三对二硫键，即50与130、71与113、102与126氨基酸残基之间各有一对二硫键；

第8页,共62页，2024年2月25日，星期天（3）丝氨酸蛋白酶结构域(144-411位氨基酸残基),位于其羧基端的His204、Asp255与Ser356三个氨基酸残基构成该酶的活性中心，Asn302为糖化位点,该区共有5对二硫键，即在148-279、189-205、197-268、293-258和368-380氨基酸残基之间各有一对二硫键；

（4）连接区(第136-143位氨基酸残基)。

第9页,共62页，2024年2月25日，星期天六、pro-UK的理化性质

pro-UK分子有四个酶切位点：（1）第一个酶切位点在158位赖氨酸与159位异亮氨酸之间，纤溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶和半胱氨酸内肽酶及因子Ⅻ

可水解该酶切位点之间的肽键。该位点被切开后，148位与279位的二硫键将A链和B链相连接，A链C末端的赖氨酸自动脱落，pro-UK即变成具有高度催化活性的双链尿激酶(UK)；

第10页,共62页，2024年2月25日，星期天（2）第二个酶切位点在135和136两个赖氨酸之间，高分子双链UK可被纤溶酶继续水解该酶切位点，并脱去N-末端的第136位赖氨酸，变成低分子双链UK，分子量为33KD，其活性与高分子UK相同；

（3）第三个酶切位点在143位谷氨酸与144位亮氨酸之间，蛋白酶可裂解该肽键产生分子量为32KD的单链低分子尿激酶原(pro-UK)，其溶血栓活性生花特性与高分子pro-UK相似；

第11页,共62页，2024年2月25日，星期天（4）第四个酶切位点在156位的精氨酸与157位的苯丙氨酸之间，凝血酶可水解该位点的肽键，生成双链pro-UK，由148位与279位的二硫键将A、B两条链相连接起来，其活性只有双链UK的1/500，但其催化活性与生化特性与单链pro-UK相似。纤溶酶可水解B链N-端第157和158两个氨基酸，生成双链UK。

pro-UK在溶液中不稳定，容易逐渐水解成小分子尿激酶原或变成双链尿激酶，但其冻干品在4℃以下是稳定的。

第12页,共62页，2024年2月25日，星期天七、尿激酶原的血栓溶解特异性1、pro-UK本身活性很低，在血浆中只有微弱的活性，对体内纤溶系统影响很小，当给药剂量太大时（超过1mg/kg），部分水解成双链UK，则对体内纤溶系统有影响。pro-UK到达血栓表面，被那里的纤溶酶激活，部分变成双链UK，后者激活结合在血栓表面构型有所改变的纤溶酶原变成纤溶酶，使血栓纤维蛋白部分溶解。第13页,共62页，2024年2月25日，星期天2、当血栓纤维蛋白暴露出E-片段，单链pro-UK能直接激活结合在该片段C-端两个赖氨酸残基上的纤溶酶原，其活性增加500倍，产生大量纤溶酶，使血栓纤维蛋白迅速溶解，因此pro-UK是特异性的纤溶酶原激活剂。单链pro-UK被纤溶酶、嗜热杆菌金属蛋白酶完全激活后，其比活性与尿激酶相同（1-1.2

105IU/mg，天然尿激酶或尿激酶原的比活性的国际标准为104,000IU/mg）。

第14页,共62页，2024年2月25日，星期天尿激酶原作用机理示意图

D-domain

E-domainEABEABCDFCDF

EEEDDDPro-UKplasminogenplasminogenPlasminogenplasmonogenFDPUK，t-PA，SKplasminplasminplasminplasmin

EEEE第15页,共62页，2024年2月25日，星期天八、尿激酶原的生产工艺1、尿激酶原工程细胞的构建将人体分泌尿激酶的Detroit562细胞RNA提取出来，用反转录及基因重组技术得到构建了Detroit562细胞cDNA文库，用合成的基因探针筛选获得人尿激酶原全长cDNA，并构建成含人尿激酶原全长cDNA的重组表达质粒pMTSVT-du，采用磷酸钙法将质粒转染CHO细胞。经酶切鉴定正确后，最终挑选得到表达水平最高的CL-11G工程细胞株。该工程细胞株进行了一系列鉴定的结果表明，它符合生物制品生产细胞的要求。第16页,共62页，2024年2月25日，星期天2、细胞的微载体灌流培养

将工程细胞CL-11G细胞株从生产种子库取出，复苏依次在方瓶、搅拌瓶、转瓶内培养，基础培养基为DMEM/F12，再转入5升罐培养，细胞密度达到1×107细胞/ml后转入20L罐培养，采用多孔微载体无血清灌流培养。待细胞密度达到1×107/ml左右时，采用间隙更换部分微载体的工艺，即每隔10～15天更换约1/4微载体，每天收集培养上清11.2个体积。我们用20L罐连续培养91天，细胞密度最高达2.6×107/ml，共获培养上清1909L,平均活性为6280IU/ml,最高达11200IU/ml，总产量达到113g。第17页,共62页，2024年2月25日，星期天3、产品纯化制备工艺

采用StreamlineSP-阳离子交换色谱—SephacrylS-200HR凝胶色谱—对氨基苯甲醚亲和色谱—QAE-Sepharose阴离子交换色谱四步纯化工艺，从1909升培养上清，获得半成品80g，回收率70%以上，纯度高于98%，单链含量

98%。半成品加入保护剂和赋形剂后，经无菌过滤、分装、冻干，即成产品78.4g。连续生产5批产品，其中三批样品送国家卫生部生物制品检定所检定，23项指标全部合格。

第18页,共62页，2024年2月25日，星期天三批pro-UK电泳结果第19页,共62页，2024年2月25日，星期天九、重组人尿激酶原的

临床前安全试验1急性毒性试验：小鼠急性毒性试验结果显示，pro-UK的半数致死量（LD50）

97.5mg/kg。在14天观察期内，小鼠体重增加正常，未见任何异常，死亡率为零。第20页,共62页，2024年2月25日，星期天2

pro-UK的长期毒性试验Beagle狗的长期毒性研究结果表明，pro-UK28mg/kg和8mg/kg组每次静脉滴注后可见牙龈不同程度充血，给药后半小时明显减轻，4小时内恢复正常。用药后注射部位容易出血，需要适当延长压迫止血时间。2mg/kg组未观察到上述症状。28mg/kg组动物的Tchol、TP和Alb含量有升高趋势，凝血时间明显延长，病理学检查未观察到药物造成直接的脏器损伤。第21页,共62页，2024年2月25日，星期天3Wistar大鼠的长期毒性试验

大鼠静脉注射pro-UK3、10和30mg/kg后，三个剂量组受试动物均未出现毒性反应症状，食量、体重增长正常。13项血液学检查结果显示，RBC、Hgb、Reti、HCT、MCHC、MCH与对照组比较有显著差别或非常显著差别（P

0.05,P

0.01)，但都在正常范围波动，没有明显的时效关系和量效关系。TP、Alb与对照组比较有升高趋势，APTT时间明显延长，组织病理学检查及脏器系数测定均未发现具有毒理学意义的改变。第22页,共62页，2024年2月25日，星期天4.pro-UK的特殊毒性试验研究结果1).小鼠骨髓细胞微核试验昆明小鼠静脉注射pro-UK90mg/kg后，12、24、36、48及72小时取材检查，对多染红细胞微核率及红系细胞造血均无明显影响。各取样点的微核率及PCE/NCE值均在正常范围之内。第23页,共62页，2024年2月25日，星期天2).pro-UK的遗传毒性研究

用沙门氏菌诱变性实验平皿掺入法检测pro-UK对测试菌株TA97、TA98、TA100

和TA102的致突变作用。结果表明，pro-UK在0.1

2000

g/皿浓度范围内,在活化和非活化条件下，诱发四菌株产生的回变菌落数与相应的自发突变率和S9对照组相比无明显增加，表明pro-UK对沙门氏菌无致基因突变作用。第24页,共62页，2024年2月25日，星期天3).pro-UK的CHL细胞染色体畸变试验

pro-UK100、200、400

g/ml分别与CHL细胞接触培养24、48小时(加S96h)收获细胞，三个剂量pro-UK对CHL细胞染色体畸变率均无明显影响，也未见诱发CHL细胞染色体畸变及数目改变。第25页,共62页，2024年2月25日，星期天4).pro-UK的生殖毒性研究

小鼠致畸胎试验结果表明，小鼠妊娠后第6

15天，每天静注pro-UK1、5、15、45mg/kg，连续10天，5、15、45mg/kg各剂量组均有流产和母鼠死亡，1mg/kg和15mg/kg组存活的胎鼠各发现一个足外翻畸形，畸形率为0.9%和0.7%，均在正常范围，5mg/kg和45mg/kg组及溶剂对照组存活胎鼠未发现畸形。第26页,共62页，2024年2月25日，星期天1mg/kg剂量组未见母鼠流产、死亡，但个别母鼠仍见宫内轻度出血。15mg/kg和45mg/kg组腭裂畸形率明显增高，5mg/kg及1mg/kg组的腭裂畸形率与空白对照组相当。实验结果提示，该药与其它溶栓药一样，孕妇患者要慎用。第27页,共62页，2024年2月25日，星期天十、pro-UK的一般药理学试验

通过小鼠(剂量：5.2、10.4、20.8mg/kg)，大鼠(剂量:3.6、6.0、12.0mg/kg)，犬(剂量:0.6、1.2、2.4mg/kg)和豚鼠回肠(剂量:1

10-6和1

10-5g/ml)的一般药理学试验的结果表明，pro-UK对受试动物的一般行为、状态及中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统、消化系统等均无明显影响。对出血时间和血小板凝结功能也无明显影响。仅发现犬实验中手术创面有渗血现象，实验结束后全身血液有类似肝素化状态。第28页,共62页，2024年2月25日，星期天十一、pro-UK的药效学试验结果

11.1pro-UK对家兔外源性血栓的溶栓作用:

用体外血栓形成仪制备血栓，染色后经颈静脉注入家兔体内，观察不同剂量pro-UK的溶栓作用，并与UK进行比较。结果表明，pro-UK与UK同等剂量的溶栓作用相似，pro-UK的溶血栓功能随剂量增加而增强，其溶栓率与对照组比较差异非常明显(P

0.001)，正常家兔对注入的血栓有一定生理性溶解作用。揭示pro-UK对家兔试验性血栓有明显的溶解作用。第29页,共62页，2024年2月25日，星期天表1pro-UK对实验兔肺血栓的溶解作用组别剂量动物数原血栓重24h后栓重溶栓率

(U/kg)(只)(mg)(mg)(%)

对照组0832.25

2.05

23.88

2.30

25.95

5.42

100008

31.75

1.58

15.38

4.96

52.47

14.58

UK200008

30.25

1.49

13.38

4.72

56.27

14.90

40000730.43

1.62

9.71

3.25

68.30

9.70

80000731.43

1.99

11.71

6.29

63.12

18.82

pro-UK100005

32.00

2.35

15.40

5.13

52.48

14.47

20000830.25

1.28

15.88

3.18

51.54

9.75

40000832.38

1.77

12.88

3.94

59.72

14.19

80000831.25

1.49

9.50

3.63

69.69

11.25

160000832.38

1.85

8.25

3.33

74.44

10.25

第30页,共62页，2024年2月25日，星期天11.2pro-UK对猪冠状动脉血栓的

溶栓作用及相关指标的影响

中国试验小型猪直接用电刺激冠状动脉形成冠脉内血栓，用不同剂量pro-UK进行溶栓治疗，结果表明，UK和pro-UK对猪冠脉血栓有显著的溶栓作用，pro-UK4×104IU/kg、8×104IU/kg、16×104IU/kg三个剂量组与对照组相比均能明显缩小冠脉血栓横切面积，减轻心肌缺血程度和范围，缩小梗塞区。UK(80000IU/kg)溶栓率为40.1%，pro-UK三个剂量组的溶栓率依次为34.4%、45.6%、47.3%；对照组自溶率为6.7%。第31页,共62页，2024年2月25日，星期天对照UK（8万IU/kg)U-PA(4万IU/kg)U-PA(8万IU/kg)U-PA(16万IU/kg)UK和u-PA对冠脉血栓溶解的作用第32页,共62页，2024年2月25日，星期天pro-UK对猪冠状动脉血栓

的溶栓作用第33页,共62页，2024年2月25日，星期天pro-UK的三个剂量组的纤溶指标均无明显变化。试验结果揭示，pro-UK和UK对猪冠脉血栓均有明显溶解作用，pro-UK对全身纤溶系统影响很小，UK明显降低

2-AP含量。第34页,共62页，2024年2月25日，星期天第35页,共62页，2024年2月25日，星期天第36页,共62页，2024年2月25日，星期天第37页,共62页，2024年2月25日，星期天十二、pro-UK动物体内的

药代动力学研究1、用HPLC法研究家兔pro-UK和UK的药代动力学结果表明，单链pro-UK和双链UK分别按双指数函数和单指数函数衰减。单链pro-UK的初相半衰期(t1/2(

)=7

2分钟)与双链UK的初相半衰期（t1/2(

)=9

3分钟比较接近；单链pro-UK的末相半衰期为t1/2(

)=43

10分钟，提示单链pro-UK在体内的作用机理与双链UK不同。单链pro-UK和双链UK的药时曲线下的面积(AUC)分别为398

46KBq.min.ml-1和151

15KBq.min.ml-1。第38页,共62页，2024年2月25日，星期天2、用测定酶活力方法研究pro-UK在猕猴体内的药代动力学结果表明，当分别静注75000、150000和300000IU/kgpro-UK后，其消除半衰期分别为6.3

1.8、11.5

2.1和12.3

2.9min，半衰期随剂量增加延长，提示该药在体内存在非线性过程。静注UK150000IU/kg后，其消除半衰期为13.7

2.7min。第39页,共62页，2024年2月25日，星期天3、pro-UK的排泄实验结果表明，pro-UK主要经尿排泄，其次少量经粪便排泄。48小时经尿和粪便排泄86.2%，经尿排出的大部分是pro-UK的降解产物碎片。组织分布实验结果表明，pro-UK进入体内主要分布于尿、肾、肝脏、胆汁、心脏、血液、肺等血流丰富的组织，大脑、脂肪等组织含量很低。第40页,共62页，2024年2月25日，星期天十三、Ⅰ期临床耐受性试验1、健康受试者的遴选：受试者共23人，男11人，女12人，年龄20-35岁，平均27±6岁；体重51-73kg，平均63.7±5.2kg。所有入选者的凝血和纤溶指标均合格，乙肝表面抗原均为阴性，生化检测和心电图正常。第41页,共62页，2024年2月25日，星期天表2.23名受试者的性别、年龄、体重等情况

A组3/325.5

1.961.8

3.1B组3/328.5

6.359.3

2.7C组3/327.2

6.160.2

6.2D组2/325.0

6.457.0

4.5组别性别(男/女)年龄（岁）体重（kg）第42页,共62页，2024年2月25日，星期天表3.23名受试者凝血指标的体检结果剂量组PT(S)PA(%)APTT(S)FIB(mg/dl)A组11.12

0.4489.33

4.9328.50

1.22229.67

42.08B组10.57

0.2995.73

6.8529.13

2.86229.50

42.53C组11.22

0.6188.40

6.7431.37

2.77284.67

92.87D组11.80

0.5782.66

5.8329.24

2.34230.00

16.43第43页,共62页，2024年2月25日，星期天2、各个剂量组受试者应用不同剂量药物后均未见有不良反应，心率、心律、血压、呼吸和心电图等均无异常变化。药物注射局部也未见有刺激性反应表现或血肿、皮下出血或皮肤瘀斑等变化。每位受试者均随访5～7天，随访期间亦未发现不良反应。第44页,共62页，2024年2月25日，星期天2、受试者应用药物前后血常规和

血液生化指标的检查结果23名受试者应用药物前后血常规和血液生化指标的检查结果表明，各个剂量组试验前与给药后24小时比较，四项血常规指标，50mg组RBC稍有上升，其余各项指标都轻微减少，其结果都在正常范围，统计学分析无显著性差异；第45页,共62页，2024年2月25日，星期天23名受试者26项血液生化指标检查结果显示，各个剂量组给药后24小时都在正常范围内变化，其中35mg组碱性磷酸酶、肌酸磷酸激酶，50mg组乳酸脱氢酶、肌酸磷酸激酶在用药24小时后稍有降低，经过统计学分析，虽然有显著性意义，但无临床意义。尿常规给药前后无明显变化。第46页,共62页，2024年2月25日，星期天3、受试者应用药物前后

凝血指标的测定结果

受试者应用药物前后凝血和纤溶指标的测定结果表明，四个剂量组PT和INR值在给药后第2小时均略有上升。PA在给药后第2小时均稍有下降，24小时后均恢复至用药前水平，从统计结果看用药前后均无显著性。四个剂量组APTT在给药后第2小时均略有延长，24小时也均恢复到正常水平，虽然20mg组统计学分析有显著性，但延长值未超过正常值一倍,没有临床意义。第47页,共62页，2024年2月25日，星期天表4

各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化剂量组项目时间PT(S)

PA(%)APTT(S)INRFIB(mg/dl)

FDP(

g/ml)PLG(%)

2-AP(%)5mg给药前11.43

0.6286.17

5.6047.00

35.391.15

0.06225.83

185.26

10114.67

38.7684.03

6.99给药后2小时11.50

0.4376.55

17.9964.00

41.601.29^

182.75

49.48

10114.27

37.2483.55

3.65给药后24小时11.25

0.4087.67

4.3728.33

1.751.15

0.07219.20

64.20

1040*117.03

36.33105.53

34.6020mg给药前11.08

0.6490.25

6.8530.75

3.101.11

0.09192.00

34.13

1091.05

34.8788.78

9.99给药后2小时11.92

1.7183.17

14.0554.83*

14.361.27

0.30196.17*

78.6610-4099.60

35.8692.95

8.94给药后24小时11.27

0.7188.00

7.6231.67*

3.081.15

0.10262.00*

79.9610-40110.90

35.06113.92

31.97第48页,共62页，2024年2月25日，星期天表5

各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化(续)剂量组项目时间PT(S)

PA(%)APTT(S)INRFIB(mg/dl)

FDP(

g/ml)PLG(%)

2-AP(%)35mg给药前11.10

0.1489.30

1.7231.67

4.581.13

0.02262.38

121.38

10120.07

39.07126.83

26.33给药后2小时12.05

1.8081.82

13.5440.90

10.321.30

0.32234.50

132.610-40

4096.52

32.04110.83

22.64给药后24小时11.87

1.5083.22

11.8829.97

2.951.26

0.26305.17

78.6810-40

40,

10128.00

34.37112.35

30.8050mg给药前11.66

0.6184.42

5.7928.92

2.441.22

0.10238.80

90.99

10109.42

33.9779.62

7.44给药后2小时13.00

1.7573.20

10.9045.96

18.151.46

0.33211.40

57.58

104096.66

30.9299.02*

3.24给药后24小时11.60

0.6884.40

7.1630.20

2.391.22

0.12242.00

35.82

10120.60

40.2797.28*

4.20第49页,共62页，2024年2月25日，星期天第50页,共62页，2024年2月25日，星期天第51页,共62页，2024年2月25日，星期天第52页,共62页，2024年2月25日，星期天第53页,共62页，2024年2月25日，星期天结论

（1).23名正常受试者静脉接受重组人尿型纤溶酶原激活剂(pro-UK)5～50mg后，均未观察到任何不良反应，皮肤黏膜及其它部位未见出血；注射局部皮肤无刺激反应表现。尿常规、血常规、心电图以及血液生化26项测定指标也均在正常范围。表明该药物对身体各系统、以及对肝、肾功能均无明显毒性作用。

第54页,共62页，2024年2月25日，星期天（2)给药后第2小时，受试者凝血指标有所变化，PA均略有下降，APTT有延长趋势，仅在20mg组与用药前比较有显著性意义，其它各组均无显著性。纤溶指标,各个剂量组用药后FDP稍有升高，FIB、PLG和

2-AP无明显变化，说明本药对全身的纤溶系统影响小，安全性好。但因有个体差异，在用药后仍应严密观察可能出现的出血等副作用。试验结果可以认为pro-UK给药剂量在50mg以内是安全的，能耐受的。第55页,共62页，2024年2月25日，星期天十四、健康受试者iv重组pro-UK

的药代动力学

正常受试者显示健康受试者iv剂量为20mg，35mg和50mg重组pro-UK后(其中25%推注，75%在1h内恒速滴注)，血浆总pro-UK、scpro-UK和纤溶酶活性浓度-时间变化的结果显示，血浆总pro-UK、scpro-UK和纤溶酶活性浓度均依赖于剂量或滴注速度明显增高。第56页,共62页，2024年2月25日，星期天

推注后1min至1小时滴注期间，各剂量组间的各个测定时间点之间都有非常明显的统计差别(P<0.001)。而且曲线呈稳定平坦形状，表明25%的推注剂量使药物迅速达到稳态血药浓度，而恒速滴注药量有效地保持浓度在相应水平上。在滴注结束后，所有成分的浓度都迅速下降，在开始给药后6h已基本上恢复至给药前内源性物质水平。而且在滴注结束后1h内各剂量组间也可以观察到浓度的差异。第57页,共62页，2024年2月25日，星期天表6健康志愿者iv不同剂量重组pro-UK后

血浆pro-UK的药代动力学参数参数单位20mg35mg50mgN=7N=6N=6AUC(0-6h)

ng.h.mL-1

216.9±50.6501.3±152.5638.2±62.7AUC(0-

)ng.h.mL-1229.0±56.1535.0±177.1652.0±65.2MRTh1.5±0.21.5±0.1

1.2±0