分析化学：5.4 高效液相色谱法

2024/4/29第五章

色谱分析法5.4.1高效液相色谱法的特性5.4.2流程及主要部件5.4.3主要分离类型与操作条件选择5.4.4高效液相色谱法的应用第四节

高效液相色谱法2024/4/295.4.1

高效液相色谱法的特性

特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2024/4/295.4.2流程及主要部件液相色谱仪2024/4/29液相色谱仪（2）2024/4/29液相色谱仪（3）2024/4/29液相色谱仪（4）2024/4/29液相色谱仪（5）2024/4/29液相色谱仪（6）2024/4/29流程及主要部件2024/4/292.主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105

Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。2024/4/29(2)梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2024/4/29(3)进样装置流路中为高压力工作状态，使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：2024/4/29(4)高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2024/4/29(5)高效液相色谱检测器紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9g·mL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。2024/4/29光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2024/4/295.4.3

主要分离类型与操作条件的选择

1.主要分离类型（1）吸附色谱（液-固吸附色谱）以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。（2）分配色谱（液-液分配色谱）早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。2024/4/29（3）离子交换色谱固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。（4）凝胶色谱（空间排阻色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。2024/4/29高效液相色谱分离类型选择示意图

2024/4/292.

影响分离的因素及操作条件选择在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即：

H=A+Cu

故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。2024/4/29（1）影响分离的因素——流速流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。2024/4/292.固定相及分离柱

气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。2024/4/293.流动相及流动相的极性

（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。

2024/4/29流动相组成

流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2024/4/29选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2024/4/295.4.4

高效液相色谱法的应用1.水不溶性物质的分析

固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC

柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器2024/4/292.水溶性物质的分析如有机酸碱化合物：离子交换树脂为固定相，无机酸碱的水溶液为流动相，采用离子交换的分离方式进行分析。对于溶于水，不离解的试样，可采用反相液液分配色谱的分离方式。

2024/4/293.手性化合物分离手性化合物分离：采用手性固定相。目前应用较多的高效液相色谱手性固定相有手性冠醚和环糊精。

2024/4/294.液相制备色谱高效液相色谱法还可利用其高效分离的特点，将柱后流出的组分分别收集，蒸去流动相后获得难以通过一般方法制备的高纯度样品（色谱