基因工程和基因组学

关于基因工程和基因组学1971年，Smith等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1972年，Berg等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来

得到新的DNA分子。第2页,共161页，2024年2月25日，星期天1973年，美国斯坦福大学医学院的Cohen教授及其同事把抗四环素基因插入大肠杆菌质粒DNA后，组成一个重组DNA，结果发现这一个重组DNA能在大肠杆菌中复制,并具有抗四环素遗传表型。StanleyN.Cohen第3页,共161页，2024年2月25日，星期天1974年,Cohen教授和加州大学的Boyer教授，将非洲蟾蜍的rRNA结构基因插入大肠杆菌质粒DNA，再转化入大肠杆菌，结果发现非洲蟾蜍的rRNA结构基因得到表达。上述实验说明，经DNA重组后的外源基因可在宿主体内成功表达。HerbertW.Boyer第4页,共161页，2024年2月25日，星期天1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1985年，转基因植物获得成功。1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。1996年，克隆羊诞生。第5页,共161页，2024年2月25日，星期天以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积由1996年的2550万亩发展到2009年的20亿亩，14年间增长了79倍。19961997199819992000200120022006200720082009第6页,共161页，2024年2月25日，星期天广义遗传工程包括:生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。狭义遗传工程是指:基因工程(重组DNA技术)。

一、基因工程概述:第一节基因工程第7页,共161页，2024年2月25日，星期天１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式,按照预先设计的蓝图，借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向获得新遗传性状的一门技术。基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。

第8页,共161页，2024年2月25日，星期天切接转增检2．基因工程操作过程：第9页,共161页，2024年2月25日，星期天3．内容：①从细胞和组织中分离DNA；②限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段；③

将酶切DNA分子与载体DNA连接

构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNA分子；④

把重组DNA分子引入宿主受体细胞

复制；⑤

重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞

建立无性繁殖系(Clone)或发育成个体；⑥

从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子；⑦

使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质并分离、鉴定基因产物。目的基因载体转化与鉴定内切酶重组DNA表达第10页,共161页，2024年2月25日，星期天一般而言，一个基因

是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。二、基因的分离与鉴定利用这一技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。第11页,共161页，2024年2月25日，星期天㈠从基因库中分离基因：1.构建基因库（library）基因库是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。根据克隆核酸序列、来源，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。第12页,共161页，2024年2月25日，星期天①核基因库：核基因库(genomiclibrary)：将某生物全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。第13页,共161页，2024年2月25日，星期天构建文库可采用不同的载体：

质粒载体：重组质粒导入感受态细胞，收集所有菌落。噬菌体或(柯斯质粒)载体：重组DNA包装进噬菌体，感染细菌，收集噬菌斑。BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体：重组人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基因库。第14页,共161页，2024年2月25日，星期天第15页,共161页，2024年2月25日，星期天第16页,共161页，2024年2月25日，星期天②染色体基因库：将基因组的一部分如一条染色体用来构建基因库

可选择特异基因以及分析染色体结构和组织。第17页,共161页，2024年2月25日，星期天果蝇的多线染色体中，对染色体进行微切割，构建染色体区段基因文库。如对X染色体上多线染色体带的分析。第18页,共161页，2024年2月25日，星期天人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离(flowcytometry)技术将人类染色体分开，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。流式细胞分离原理第19页,共161页，2024年2月25日，星期天酵母菌：利用改良的脉冲电泳方法(pulsedfieldgelelectro–phoresis,PFGE)，将酵母菌16根染色体据其分子量大小分开后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。第20页,共161页，2024年2月25日，星期天③cDNA库：以mRNA为模板

经反转录酶合成互补DNA

构建基因库。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列,利用一段多聚T为引物与多聚A互补配对，在反转录酶的作用下，即可获得cDNA第一链。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列

得到的双链DNA分子经两端补齐后

以带有限制性酶切点的人工接头连接

酶切后与载体(通常是噬菌体)连接

制备cDNA库。第21页,共161页，2024年2月25日，星期天mRNA1.cDNA第一链的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs第22页,共161页，2024年2月25日，星期天2.cDNA第二链的合成

煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1TTTTTTTTTTTTTTp5’第23页,共161页，2024年2月25日，星期天DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’S15’AAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’T4-DNAligase5’AAAAAAAAAAAAAAp3’TTTTTTTTTTTTTTOH5’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’第24页,共161页，2024年2月25日，星期天dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5G

G

AAAAAOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPs第25页,共161页，2024年2月25日，星期天

cDNA库与核DNA库不同：cDNA库仅具有细胞或组织内表达基因的mRNA序列

仅包括基因组的部分基因序列。

cDNA库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。

通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。第26页,共161页，2024年2月25日，星期天2.筛选基因库：根据待选基因相关信息

确定筛选方法和条件

从基因库中筛选、分离基因；常用的基因库筛选方法有表型筛选法、杂交筛选法、混合池PCR筛选法、差减杂交法、图位克隆法、酵母双杂交法等；多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针

筛选基因库。第27页,共161页，2024年2月25日，星期天密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆文库筛选流程第28页,共161页，2024年2月25日，星期天筛库过程：将转化或转染后菌落印影在滤膜上

用碱裂解、中和后洗涤烘干

再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探针进行杂交放射性自显影

凡黑点菌落即为阳性克隆。影印洗涤杂交感光第29页,共161页，2024年2月25日，星期天①.限制性酶图谱：构建阳性克隆的限制性酶图谱

根据同源性分析，可了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置

用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。(二)阳性克隆的分析与鉴定：从基因库中筛选出的阳性克隆

分析、鉴定

得到目的基因。第30页,共161页，2024年2月25日，星期天限制性酶图谱构建方法(15kb)将阳性克隆DNA分装3个管中

酶切DNA

琼脂糖凝胶电泳

溴化乙锭染色

紫外灯下见到DNA带。

从凝胶电泳结果分析：模式Ⅱ就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。第31页,共161页，2024年2月25日，星期天用类似的方法，将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性

来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。第32页,共161页，2024年2月25日，星期天②.核酸分子杂交：Southern杂交分析：由英国的Southern发明(1975)，一种将琼脂糖中的DNA转移到尼龙膜

进行DNA分子杂交分析的方法。筛选基因库得到阳性克隆后

将限制性酶酶切与Southern杂交结合

绘制限制性酶图谱。第33页,共161页，2024年2月25日，星期天Northern杂交分析：用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检测mRNA的存在。原理和程序与Sorthern杂交相同。Western杂交分析：用于蛋白质的分析。第34页,共161页，2024年2月25日，星期天③.核酸序列测定克隆后的DNA片段进行核酸序列测定后

确定该DNA片段序列的正确性。一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法测定核酸序列。CGCTCAGCTGGTGATTGTGT第35页,共161页，2024年2月25日，星期天55333

-5

磷酸二酯键第36页,共161页，2024年2月25日，星期天在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：第37页,共161页，2024年2月25日，星期天④.核酸序列分析：测定的核酸序列为何基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一步分析。第38页,共161页，2024年2月25日，星期天（1）同源性比较将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的同源性，将序列发送到Genbank等DNAData数据库进行比较。EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,网址：http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,网址：;Swissport/TREMBL网址：/sprot第39页,共161页，2024年2月25日，星期天第40页,共161页，2024年2月25日，星期天第41页,共161页，2024年2月25日，星期天第42页,共161页，2024年2月25日，星期天第43页,共161页，2024年2月25日，星期天第44页,共161页，2024年2月25日，星期天

对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有翻译起始信号和终止信号等。（2）分析核酸序列的阅读框架第45页,共161页，2024年2月25日，星期天

GmMYBZ2ORF：744bp247aaMYB-DNAbinding1:13-63aaMYB-DNAbinding2:65-114aa具有转录抑制作用的保守基序：pdLNLD/ELXiG/S

第46页,共161页，2024年2月25日，星期天

GmMYBZ2空间结构预测（CHPmodels-2.0服务器）GmMYBZ2蛋白的三维空间结构预测红色：a-螺旋；蓝色：b-折叠；白色：无规卷曲

第47页,共161页，2024年2月25日，星期天（三）PCR扩增基因：聚合酶链式反应(polymerasechainReaction,PCR)可以体外快速扩增DNA。美国Mullis(1986)发明，是现代生物学发展史上的一个里程碑。PCR技术是以DNA互补链的聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性杂交，由DNA聚合酶催化引物延伸，最终获得特异DNA片段的体外扩增方法。第48页,共161页，2024年2月25日，星期天DNA模板变性退火延伸循环1变性退火延伸循环2RF1324第49页,共161页，2024年2月25日，星期天变性退火延伸循环31234第50页,共161页，2024年2月25日，星期天基本要素模板：待拷贝的DNA,可以是双链,也可是单链DNA；引物：引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物；DNA聚合酶：DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。dNTP：DNA合成的底物。使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。第51页,共161页，2024年2月25日，星期天（四）人工合成基因：根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来

可很快地人工合成基因。如SOE-PCR(splicingbyusingoverlappedextension)技术

可扩增出完整的基因序列。第52页,共161页，2024年2月25日，星期天化学合成的寡聚核苷酸(80-100个核苷酸)

通过SOE将单链部分补齐；2.PCR扩增DNA片段；3.DNA变性；4.两个单链部分经SOE补齐

双链；5.PCR扩增DNA，利用多级SOE-PCR扩增出完整的基因。第53页,共161页，2024年2月25日，星期天1.限制性内切酶(restrictionenzyme)：一类能识别双链DNA分子中一段特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

三、限制性内切核酸酶第54页,共161页，2024年2月25日，星期天2.限制性内切酶的命名：用属名的第一个字母和种名的前两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称;如：大肠杆菌(Escherichiacoli)

用Eco表示；流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)

用Hin表示。用一个写在右下方的字母代表菌株或类型；如EcoK，Hind。用罗马数字表示不同的限制和修饰体系，如：HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等。第55页,共161页，2024年2月25日，星期天3.限制性内切酶的类别：第Ⅰ类酶:每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性,酶切位点不定。

第Ⅱ类酶:能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列。第Ⅲ类酶:能识别位点分别是AGACC和CAGCAG,切割位点则在下游24-26bp处。第56页,共161页，2024年2月25日，星期天4.第Ⅱ类核酸内切酶特性：在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂；靶序列：具有双重旋转对称结构的回文序列；ABCC′B′A′ABCC′B′A′ABNB′ABN′B′A′A′回文序列(palindrome)：从两个方向阅读而序列相同的序列。第57页,共161页，2024年2月25日，星期天对靶序列的切割：(1)

产生平末端(bluntend)的切割如SmaⅠ：两条链上的断裂位置处于一个对称结构的中心。第58页,共161页，2024年2月25日，星期天(2)产生粘性末端(stickyend)的切割两条链上的断裂位置是交错的、但又是对称地围绕一个对称轴排列。如EcoRⅠ：粘性末端:

DNA分子在限制性内切酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构。第59页,共161页，2024年2月25日，星期天第60页,共161页，2024年2月25日，星期天同裂酶:来源不同但可识别相同核苷酸靶序列，产生同样的切割并形成同样末端的限制酶。如HpaⅡ和MspⅠ均可识别CCGG。同尾酶:来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生同样粘性末端的限制酶。BamHⅠGGATCCBclⅠTGATCA第61页,共161页，2024年2月25日，星期天载体：将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。

DNA片段与适合的载体DNA连接构成重组DNA

在载体DNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进行复制。DNA载体：质粒、噬菌体DNA、病毒DNA、细菌或酵母菌人工染色体等。四、载体（vector）：第62页,共161页，2024年2月25日，星期天载体的条件：①具有复制原点，能自我复制；②具有多克隆位点(multiplecloningsite，MCS)即有多种限制酶的切点；③具有选择标记基因，如抗生素基因；④易从宿主细胞中回收。第63页,共161页，2024年2月25日，星期天（一）细菌质粒：质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA片段。在细胞内的复制程度：严紧型：一个细菌细胞内的质粒数量有1-2个；

松驰型：每个细胞内有的20-60个。第64页,共161页，2024年2月25日，星期天pUC18质粒具有以下特点：③多克隆位点中的酶切位点多，克隆方便；④具有a－互补的显色表型，用于检测重组质粒的选择标记。①分子量小，可接受较大外源片段(10Kb)；②拷贝数多，每个细胞中有500个；第65页,共161页，2024年2月25日，星期天a-互补：指来自细菌DNA的b-半乳糖苷酶(lacZ)N端的一段氨基酸残基(a-肽)，在与a-肽缺失的b-半乳糖苷酶混合后，能够回复lacZ酶活性的一种基因内互补现象。第66页,共161页，2024年2月25日，星期天基因组全长49kb。噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，位于两端的为DNA左、右臂。中间基因簇可被外源DNA替代而不影响浸染细菌的能力。能接受15-23kb外源DNA片段，可以作为cDNA或核DNA克隆的载体。（二）λ噬菌体(温和型)：第67页,共161页，2024年2月25日，星期天

优点：2.不易引起生物危害，有助于“目的”基因进入细胞并增殖；1.携带大片段外源DNA分子，可占用总量的25%时仍不失活。第68页,共161页，2024年2月25日，星期天（三）柯斯质粒(cosmid)：部分λ噬菌体DNA+部分细菌质粒DNA序列组建

柯斯质粒。带有噬菌体cos序列和细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。第69页,共161页，2024年2月25日，星期天这种质粒分子量较小，但可接受长达50kb的外源DNA片段，在克隆真核生物基因中十分有用。∵一个长片段DNA可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。第70页,共161页，2024年2月25日，星期天（四）细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)BAC载体可以携带大于50kb的外源DNA片段。

特点：带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的；载体本身分子量很小(7.4kb)；选择标记：氯霉素抗性基因；

多克隆位点位于lacZ基因内。F因子经基因工程改造成BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段。第71页,共161页，2024年2月25日，星期天（五）酵母人工染色体(YAC)：YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受100-1000kb的外源DNA片段。YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；并促进了人类人工染色体(humanartificialchromosome，HAC)的研究。1996年完成了酵母菌全基因组序列的测定第72页,共161页，2024年2月25日，星期天指能在两种不同的生物中复制的载体。如能在原核生物（如E.coli）、真核细胞（如酵母）中复制的载体。穿梭载体需同时具有细菌质粒的复制原点、真核生物自主复制序列(Auto-nomouslyreplicatingsequence,ARS)以及两者的选择标记。（六）穿梭载体(shuttlevectors):第73页,共161页，2024年2月25日，星期天穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增基因，在酵母菌中用于基因表达分析。

酵母菌的YEp(yeastepisomaplasmid)和YRp系列载体均是穿梭载体。穿梭质粒YEp24第74页,共161页，2024年2月25日，星期天

pCAMBIA2301载体第75页,共161页，2024年2月25日，星期天第76页,共161页，2024年2月25日，星期天（七）Ti质粒及其衍生载体：适合于植物的载体系统

将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。Ti质粒是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌(革兰氏阴性菌)(Agrobacteriumtumefaciens)细胞中

可诱导植物产生瘤细胞(tumor-Inducing

Ti)

冠瘿瘤(growngalltumors)。第77页,共161页，2024年2月25日，星期天Ti质粒一部分DNA叫转移DNA(transferDNA，T-DNA)，当农杆菌感染植物时，T-DNA便转移到植物的染色体上，诱导冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱(opine),作为农杆菌的碳源和氮源。农杆菌感染产生冠缨瘤第78页,共161页，2024年2月25日，星期天第79页,共161页，2024年2月25日，星期天第80页,共161页，2024年2月25日，星期天第81页,共161页，2024年2月25日，星期天目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。五、基因工程的应用具有生长激素的转基因鼠第82页,共161页，2024年2月25日，星期天㈠基因工程工业

最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(1982)。

胰岛素是一种控制糖代谢的蛋白质激素。不能产生胰岛素的患者会有糖尿病，患者必须每天注射胰岛素。

现已在细菌中生产10多种医药产品，如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。第83页,共161页，2024年2月25日，星期天胰岛素的人工生产第84页,共161页，2024年2月25日，星期天

有些真核细胞的蛋白质需要糖基化等修饰加工以后才具有活性，而细菌细胞缺少真核细胞的这些修饰系统

真核生物细胞更适合于表达真核生物蛋白质基因。

目前，酵母菌、植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞成功地均应用于表达外源蛋白。基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素第85页,共161页，2024年2月25日，星期天（二）植物基因工程

植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞被内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。基因转化的方法和技术第86页,共161页，2024年2月25日，星期天

农杆菌转化法和基因枪转化法应用最多。第87页,共161页，2024年2月25日，星期天1.根癌农杆菌转化技术：根癌农杆菌介导的植物转化是应用的最早最广泛的植物转化方法（双子叶植物、单子叶植物）。过程：将目的基因与启动子（花椰菜病毒35S）及终止子组成嵌合DNA分子；插入到Ti衍生质粒RB与LB内构成重组质粒；再转化到农杆菌细胞；将重组农杆菌去感染植物细胞（组织）；使Ti质粒的部分DNA（携带目的基因），整合到植物染色体，实现遗传转化。第88页,共161页，2024年2月25日，星期天利用从抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分离克隆的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合成酶）基因，已培育出高抗除草剂转基因植物。第89页,共161页，2024年2月25日，星期天基因枪法植物转化是通过高压气体为动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒

将目的基因直接导入植物细胞，并整合到染色体上的方法。2.基因枪转化技术：转化的载体多数是以pUC系列质粒为基础构建的。它们通常具有细菌复制原点及抗性选择标记，具有可在植物中表达的启动子终止子及调控序列，以及植物抗性选择标记(如除草剂、潮霉素等抗性)。第90页,共161页，2024年2月25日，星期天

几种基因枪类型的共同特点：是用一种动力系统将包被DNA的金属微粒导入受体细胞或组织进行转化。1.位于高压气体桶底部的爆破片；2.载有重组DNA和金属微粒的微弹载体；3.阻拦网；

4.

包裹有重组DNA的金属微粒；5.被轰击样品。第91页,共161页，2024年2月25日，星期天㈢转基因动物:与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。这主要涉及到一些技术难题，以及伦理学、宗教等问题。转基因动物：将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体表达外源基因的动物，称为转基因动物。第92页,共161页，2024年2月25日，星期天转基因动物是如何获得的呢？第93页,共161页，2024年2月25日，星期天受体细胞的准备受精卵：注射促性腺激素，使动物超数排卵，从而收集、获得合适的受精卵；胚胎干细胞：从早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离获得具有正常二倍体染色体和发育全能性的细胞。基因的准备线形DNA或环形DNA均可，但线形DNA整合率要高于环形DNA；环形DNA在细胞内的半衰期较长，使用于瞬时表达和基因治疗。第94页,共161页，2024年2月25日，星期天基因的转化利用显微注射法、电击法、脂质体介导等方法将目的基因转入受体细胞中；通过筛选基因筛选阳性转化子；阳性转化子的培养将阳性转化子转入合适的培养基中，培养至囊胚期；第95页,共161页，2024年2月25日，星期天第96页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎移植胚胎移植：将供体的受精卵或早期胚胎，移植到同种的生理状态相同的其他受体体内，使之继续发育成为新个体的技术，也称作借腹怀胎。转基因个体的鉴定对代孕母兽产下的幼兽进行相关分子鉴定，首先，检测目的基因是否整合到了受体的基因组中；其次，检测目的基因是否表达；最后进行表达产物的分离纯化及生物活性检测。第97页,共161页，2024年2月25日，星期天第98页,共161页，2024年2月25日，星期天卵细胞的获得费时费力；很多人认为，从胚胎中收集胚胎干细胞是不道德的，因为动物的生命没有得到珍重，动物的胚胎也是生命的一种形式，无论目的如何高尚，破坏胚胎是不可想象的；动物的体细胞是否可以作为转基因的受体细胞呢？第99页,共161页，2024年2月25日，星期天生物学家一度认为，由一个成熟的动物细胞“无性繁殖”成一个子体是不可能的。1997年，克隆羊“多莉”的诞生，彻底打破了这种不可能性，并立即引起世界的震惊和媒体的关注。第100页,共161页，2024年2月25日，星期天克隆羊“多莉”的诞生300个277个29个1只第101页,共161页，2024年2月25日，星期天乳汁中含有α抗胰蛋白酶转基因羊各种克隆动物相继诞生第102页,共161页，2024年2月25日，星期天1997年，夏威夷科学家从成年小老鼠的细胞复制出第一只克隆小老鼠，名叫Cumulina。Cumulina两岁零七个月死亡,这是一个比较正常的死亡年龄，比普通老鼠的平均寿命长7个月。它曾经生产了两次。第103页,共161页，2024年2月25日，星期天1998年日本科学家用子宫和输卵管细胞成功克隆牛,首两头克隆牛分别名为“KAGA一号”和“NOTO一号”之后，日本复制出了数千克隆牛。出生于一九九八年八月的克隆牛“KAGA二号”产下了小牛。第104页,共161页，2024年2月25日，星期天世界上第一批三只克隆山羊已由美国一家生物公司于1998年“制造”出来。克隆山羊Mira和她的姐妹们都来自美国的实验室，它们生产含有人类抗凝血酶-3的羊奶。抗凝血酶-3是血液天然含有的蛋白质，其功能是协助控制血凝。第105页,共161页，2024年2月25日，星期天2000年，科学家从两头分别死亡将近18小时和24小时的雌盘羊卵巢内取出DNA，将其注入盘羊的“近亲”――普通白羊的卵细胞内，克隆出了一只摩弗伦羊（又称欧洲盘羊）。这是世界上首次把克隆技术应用于一种濒临灭绝的哺乳类动物身上。第106页,共161页，2024年2月25日，星期天2003年5月29日，一头名叫“爱达荷宝石”的克隆骡子在美国爱达荷大学（UniversityofIdaho）与公众见面第107页,共161页，2024年2月25日，星期天2005年韩国科学家培育出世界首只克隆狗“斯纳皮(Snuppy)”第108页,共161页，2024年2月25日，星期天2005年10月意大利著名的克雷莫纳繁殖技术研究中心成功地克隆出了14只小猪仔第109页,共161页，2024年2月25日，星期天2006年11月美国维亚金公司宣布成功克隆出纯种赛马“克莱顿”第110页,共161页，2024年2月25日，星期天我国体细胞克隆牛"康康"，在莱阳农学院动物胚胎工程中心第111页,共161页，2024年2月25日，星期天西北农林科技大学克隆山羊第112页,共161页，2024年2月25日，星期天山东曹县五里墩中大动物胚胎工程中心第113页,共161页，2024年2月25日，星期天人类生长激素转基因猪同胞鼠对照转移有人类生长激素转基因鼠第114页,共161页，2024年2月25日，星期天转基因荧光猪第115页,共161页，2024年2月25日，星期天㈣遗传疾病诊断：利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平进行诊断

准确度高，速度快。进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。第116页,共161页，2024年2月25日，星期天b-球蛋白基因MstⅡ酶切结果第117页,共161页，2024年2月25日，星期天㈤基因治疗：利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者的基因组中

治疗遗传疾病，通常叫做基因治疗(genetherapy)。方法：利用减毒的病毒DNA作载体(retrovirusDNA)

构建重组DNA分子

用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞

将正常基因整合到染色体上。第118页,共161页，2024年2月25日，星期天例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retrovirus载体，已用于治疗严重综合免疫缺陷(SCID)。SCID是由于腺苷脱氢酶基因(adenosinedeaminase，ADA)突变引起的，患者无任何免疫功能。第119页,共161页，2024年2月25日，星期天2000年法国Fischer用该方法治愈患有SCID遗传病的两个婴儿（8个月和11个月）。这一工作被认为是20世纪人类基因治疗上的重大突破。方法：将ADA基因导入到MLVretrovirus

载体中

取代该病毒DNA中的三个结构基因(gag、pol、env)

将重组后的病毒去感染T细胞，使ADA基因整合到T细胞的染色体中

实现基因治疗的目的。第120页,共161页，2024年2月25日，星期天核酸分子杂交的原理和方法+半导体技术结合

发展形成的一门新技术。这一技术可使许多分子杂交反应同时进行。

DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龙等。㈥DNA芯片(DNAchips)第121页,共161页，2024年2月25日，星期天在面积不大(如2cm２)的基片表面分成不同小格有序地点阵排列于一定位置的、可寻址的核苷酸分子；将待分析核苷酸分子标记(如用荧光)，变性成单链与芯片上序列相同的核苷酸分子杂交；与芯片上序列不同的核酸分子被洗掉；利用高精度的激光扫描仪记录分子已杂交的荧光信号；计算机软件分析。第122页,共161页，2024年2月25日，星期天基因多态性检测（如单核苷酸多态性筛选

singlenucleotidePolymorphisms，SNPs)；基因表达分析(不同细胞和不同组织的RNA群体比较)；

克隆选择及文库筛选（如cDNA文库）；基因突变检测及遗传病和肿瘤的诊断等。DNA芯片技术应用领域：第123页,共161页，2024年2月25日，星期天用基因芯片预测“未病之病”

通过基因芯片灵敏快速的检测癌基因及正常基因的表达变化,从而实现中国古语中“上医治未病”的理想,对疾病作出前瞻性的诊断,这就是“基因诊断”第124页,共161页，2024年2月25日，星期天第二节基因组学基因组学(genomics)：研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。该学科提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物、医学、和工业领域的重大问题。第125页,共161页，2024年2月25日，星期天研究对象：以整个基因组为研究单位，而不以单个基因为单位作为研究对象。研究目标：认识基因组的结构、功能和进化；

阐明整个基因组所包含的遗传信息和相互关系；

充分利用有效资源，预防和治疗人类疾病。第126页,共161页，2024年2月25日，星期天重要组成部分：基因组计划(genomeproject)大体上可分为：⒈构建基因组的遗传图谱；⒉构建基因组的物理图谱；⒊测定基因组DNA的全部序列；⒋绘制基因组的转录本图谱；⒌分析基因组的功能。第127页,共161页，2024年2月25日，星期天基因组计划研究开始于1990年。

美国启动被誉为“人体阿波罗计划”的“人类基因组计划”，投资30亿美元，历时15年

测定人类基因组的30亿个核苷酸对的排列次序

构建高分辨率的人类基因组遗传图谱和物理图谱

发展生物信息学。人类基因组计划第128页,共161页，2024年2月25日，星期天在美国提出人类基因组计划后，日本和中国分别于1991年和1992年启动了“水稻基因组计划”。第129页,共161页，2024年2月25日，星期天由于以人类为对象的研究实际上受到诸多限制，也受伦理学的约束，所以人类基因组计划还将对有关的模式生物，如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪、拟南芥等进行相应的研究，为研究人类基因组的战略提供重要的依据。第130页,共161页，2024年2月25日，星期天2002年4月5日《Science》以14页的篇幅刊登和宣布中国科学家独立绘制完成水稻基因组草图序列(总数：4.6亿)，是继人类基因组工作草图(2001年春)之后完成测定的最大基因组。(2001年12月14日美、英等国科学家宣布绘制出拟南芥基因组的完整图谱)籼稻基因组草图第131页,共161页，2024年2月25日，星期天材料：籼稻。完成单位：华大基因研究中心，中科院遗传与发育生物学研究所等12个单位，2001年7月启动。水平：水稻基因组中的总基因数约为46022~55615个（接近人类基因数的两倍），工作框架图序列已覆盖水稻整个基因组92％以上的基因。方法：“鸟枪射击法”，利用国产曙光2000、曙光3000超级计算机(1000亿次/秒)对随机DNA碎片进行排序和组装，确定其在基因组的正确位置。计划：功能基因分析和蛋白质研究。第132页,共161页，2024年2月25日，星期天2002年11月21日《Nature》宣布中国科学家独立绘制完成粳稻基因组第四号染色体精确测序图，使我国对国际水稻基因组测序计划贡献率达到10%。

粳稻基因组草图第133页,共161页，2024年2月25日，星期天材料：粳稻“日本晴”。完成单位：中科院国家基因研究中心等4家单位。整个国际水稻基因组计划始于1998年，日本、美国、中国、法国等国家和地区参加。水平：第四号染色体中的总碱基数目为0.35亿碱基对，覆盖了该染色体全长序列98％的区域，只剩下7个小空洞，测序碱基序列的精确度达到99.99%。完整测定的着丝粒序列在高等生物中属于首次。计划：对预测鉴定的4658个基因作进一步分析、着丝粒功能等研究。第134页,共161页，2024年2月25日，星期天2007年10月初，我国科学家对外宣布，他们已经成功绘制完成第一个完整中国人基因组图谱，又称“炎黄一号”，这也是第一个亚洲人全基因序列图谱。

首个中国人基因组图谱绘制第135页,共161页，2024年2月25日，星期天如果将这个基因组序列写成一本书，高度将与384米的深圳地王大厦相同。人类基因组序列图谱揭示了某个人的遗传密码，他的祖传命运、以及未来可能发生的病变。第136页,共161页，2024年2月25日，星期天在不久的将来，人类将可能人手一份“基因身份”，里面记录了只属于你自己的遗传信息。特别是某些遗传缺陷会被早发现早治疗，祖先的命运因此而不必在你身上重演。目前，在美国为一个人进行所有的基因检测费用高达2000万美元，在国内的价格也达到200万人民币。到2020年，在现有科学发展水平上为一个人绘制出基因图，可能只需要1万；第137页,共161页，2024年2月25日，星期天一、基因组图谱的构建小基因组物种常用鸟枪法测序法第138页,共161页，2024年2月25日，星期天解决方法：大基因组测序存在两个问题：片段数(n)庞大，片段间连接和装配非常复杂；基因组中相同或相似的重复序列在连接和装配时容易出错。大规模序列测定前，构建基因组图谱可作为序列测定中制定测序方案的依据，以便锚定测知的核酸序列在染色体上的位置。第139页,共161页，2024年2月25日，星期天测序方法：克隆连续序列法(clonecontig)：将基因组DNA切割长度为0.1Mb-1Mb的大片段

克隆到YAC或BAC载体上

分别测定单个克隆的序列

再装配连接成连续的DNA分子。定向鸟枪射击法(directedshotgun)：以基因组图谱中标记为依据

测序装配和构建不同DNA片段的序列。第140页,共161页，2024年2月25日，星期天基因组图谱根据构建的途径，可分为两种：遗传图谱：根据遗传性状(如已知基因位点、功能未知的DNA标记、可鉴别的表型性状)的分离比例

将其定位在基因组中，构建相应的连锁图谱。物理图谱：描绘DNA上可以识别的标记的位置和相互之间距离(以碱基对的数目为衡量单位)的图谱。第141页,共161页，2024年2月25日，星期天㈠遗传图谱的构建：1.图谱标记：凡是位于染色体上易于检测识别、在不同个体之间存在差异（多态性），而且可以稳定遗传的位点，都可以作为遗传作图的标记。缺点：基因数目有限、所构建的遗传图谱不详细、标记间的遗传距离较大。⑴.基因标记：基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形态、生化等表型性状作标记，第142页,共161页，2024年2月25日，星期天⑵.DNA标记：每种生物DNA具有稳定性，∴DNA本身可作为构建遗传图谱的标记；主要有以下3种类型：①限制性内切酶多型性②简单序列长度多型性③单核苷酸多型性第143页,共161页，2024年2月25日，星期天2、遗传图谱的构建：⑴遗传作图的遗传学原理：遗传图谱的绘制主要依据是经典的孟德尔遗传学的连锁和交换规律。通过重组率确定遗传标记在染色体上的相对位置，从而绘制遗传图谱。⑵不同模式生物的连锁分析：有性杂交实验的连锁分析及系谱分析转化、转导及结合等第144页,共161页，2024年2月25日，星期天(二)物理图谱的构建：1.构建物理图谱的原因：⑴遗传图谱的分辩率有限：⑵遗传图谱的精确性不高：第145页,共161页，2024年2月25日，星期天2.物理图谱的构建：⑴

限制性酶图谱：利用限制性内切酶绘制图谱，对于DNA分子长度<50Kb的片段，一般没有什么困难。(46=4094bp)而对于>50Kb的DNA分子，可选用稀有切点内切酶酶切DNA。(48=65536bp)第146页,共161页，2024年2月25日，星期天⑵荧光原位杂交:是另一物理图谱构建方法

通过荧光标记的探针与DNA分子杂交，使染色体上的杂交信号（位置就是探针DNA在染色体上的图谱位点）在显微镜下可直接观察。⑶序列标签位点：利用某一已知序列为标签的位点(sequencetaggedsites，STS)作探针，与基因组DNA杂交，绘制物理图谱。第147页,共161页，2024年2月25日，星期天3人类基因组物理图谱:

人类基因组序列开始测定时，已有45万个EST，其中有一些重复序列，经计算机分析筛选后得到49625个，各代表一个基因。再从中筛选出3万个EST、二个辐射杂交系