代谢控制发酵

关于代谢控制发酵代谢控制发酵的定义

它是利用遗传学或其它生物、物理、化学方法，人为地在脱氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，改变和控制微生物的生长代谢途径，使有用的代谢产物大量生成、积累的发酵技术。最早在氨基酸发酵中得到成功应用。第2页,共21页，2024年2月25日，星期天代谢调节机制微生物细胞的调节机制酶合成的调控（转录水平上的调节）诱导——促进酶的合成阻遏——抑制酶的合成（包括终产物阻遏和分解代谢物阻遏）

第3页,共21页，2024年2月25日，星期天代谢调节机制酶活性的调控一定数量的酶通过其分子结构的改变来调节催化反应的速率。控制机制：终产物抑制或激活；通过辅酶水平的活性调节；酶原的活化；潜在酶的活化细胞膜渗透性的控制根据酶在代谢调节中作用不同分为：调节酶（变构酶、同功酶、多功能酶）、静态酶和潜在酶。第4页,共21页，2024年2月25日，星期天代谢控制发酵的基本思想

切断支路代谢选育营养缺陷型突变株原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。最典型例子：高丝氨酸营养缺陷型或苏氨酸营养缺陷型菌株达到赖氨酸的积累。第5页,共21页，2024年2月25日，星期天代谢控制发酵的基本思想选育渗漏缺陷突变株遗传性障碍不完全的缺陷型。（注：这种突变只是其中某一种酶的活性降低，而不是完全丧失。不能合成过量的最终产物，故不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。）第6页,共21页，2024年2月25日，星期天代谢控制发酵的基本思想

解除菌体自身的反馈调节选育抗类似物突变株（代谢拮抗物抗性突变株）形成途径：变构酶结构基因突变；调节基因突变。酶活性的利用营养缺陷型回复突变株的应用

调节酶的失活与否，可能直接表现为某种营养缺陷型。可以采用回复突变的方法，从回复突变株中获得多途径中的调节酶接触反馈调节的调节突变株。第7页,共21页，2024年2月25日，星期天代谢控制发酵的基本思想

增加前体物的合成通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体合成，有利于目的产物的大量积累。去除终产物特殊调节机制的利用：①多种产物控制机制的利用②平衡合成的利用③代谢互锁的利用④优先合成的变换。条件突变株的应用选育不生成副产物的菌株选育生产代谢拮抗物质的菌株

第8页,共21页，2024年2月25日，星期天

微生物代谢控制发酵的措施应用营养缺陷型菌株。选育抗反馈调节的突变株。

即已解除了反馈调节作用的突变株。因为反馈抑制和阻遏，或两者引起的自动调节作用已被削弱或解除，所以能合成较多的最终产物。选育细胞膜通透性突变株：使终产物在细胞内不能大量积累而引起反馈调节。利用营养缺陷型回复突变株或条件突变株的方法，解除终产物对关键酶的调节。应用遗传工程技术，创造理想的超微生物（构建目的工程菌株）。发酵的环境条件的优化。第9页,共21页，2024年2月25日，星期天发酵条件控制

当菌株选育确定后，环境条件的合适与否是发酵成败的重要因素。环境条件既影响微生物生长，又影响代谢速度和方向及产物的形成和积累。影响发酵过程的因素很多，如温度、pH、通风、搅拌、罐压力、溶氧量等，必须适当控制各种条件，掌握发酵动态，是整个发酵过程顺利进行。例如谷氨酸棒杆菌发酵，可以通过控制发酵条件包括O2浓度、NH4浓度、pH、磷酸盐浓度、生物素浓度等，转换代谢方向，使其不生成Glu，而生成乳酸、a-KGA、琥珀酸、谷酰胺等产物。第10页,共21页，2024年2月25日，星期天氨基酸的代谢控制与发酵（以Lys生产为例）赖氨酸第11页,共21页，2024年2月25日，星期天氨基酸的代谢控制与发酵（以Lys生产为例）切断或减弱支路代谢切断支路代谢：选育和应用营养缺陷型菌株，切断丙氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的分支途径以积累Lys。变换优先合成：渗漏缺陷型的选育（高丝氨酸渗漏突变株）降低HD酶（高丝氨酸脱氢酶）活性：增强代谢流从优先合成Met和Thr转向合成Lys，Met和Thr

、Thr合成减少，解除了Thr+Lys的协同反馈抑制。第12页,共21页，2024年2月25日，星期天氨基酸的代谢控制与发酵（以Lys生产为例）解除反馈抑制选育抗结构类似物突变株解除AK酶的反馈调节通过诱变，使编码AK酶（天冬氨酸激酶）的结构基因发生突变，使AK酶对Lys及结构类似物不敏感，即使苏氨酸过量，该激酶也不与Lys或类似物结合。解除PS酶的代谢调节解除代谢互锁：赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在代谢互锁，应考虑选育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸结构类似物突变株。第13页,共21页，2024年2月25日，星期天氨基酸的代谢控制与发酵（以Lys生产为例）去除终产物选育细胞膜通透性突变株，解除反馈调节。选育生物素缺陷型。生物素是脂肪酸合成中CoA的辅酶。选育生物素缺陷型阻断生物素合成并限制外源供应量，导致磷脂含量不足，细胞膜结构不完整。选育油酸缺陷型。选育甘油缺陷型。选育温度敏感性突变株。第14页,共21页，2024年2月25日，星期天氨基酸的代谢控制与发酵（以Lys生产为例）增加前体物的合成反馈抑制（调节）并不意味着完全阻止合成反应，通过受控制反应物的第五积累能拮抗性地克服这种抑制，关键酶AK所催化的底物Asp（天门冬氨酸），AK酶的反应速度与底物Asp浓度间的关系呈S型，随着Asp的增多，AK酶和Asp亲和力协同性地增大。根据变构酶S型动力学性质，应设法增加前体物质Asp的浓度，以抵消变构抑制剂的影响。可以选育丙氨酸缺陷型，抗Asp结构类似物的突变株。第15页,共21页，2024年2月25日，星期天氨基酸的代谢控制与发酵（以Lys生产为例）选育温度敏感突变株其突变位置发生在亮氨酸合成酶系，高丝氨酸脱氢酶或丙酮酸-L-氨基酸转氨酶编码的基因中，均有利于积累Lys缺陷型。第16页,共21页，2024年2月25日，星期天氨基酸的代谢控制与发酵（以Lys生产为例）利用细胞工程和基因工程技术构建赖氨酸工程菌株细胞融合选育高产Lys菌株操作步骤如下：第17页,共21页，2024年2月25日，星期天0.3μg/mLPenicilian（31℃，90分钟）Centrifugation收集菌体，高渗洗涤后，悬浮于高渗溶液中300μg/mLLysozyme（31.5℃静止21h）ProtoplantA等量混合离心33%PEG6000+0.1MCaCl2处理，36℃，15min进行融合，融合反应液离心后，收集融合原生质体悬浮于pH10.5高渗溶液中移植到（涂布）选择固体琼脂培养基上的高渗软琼脂层中31.5℃，培养14天记Fusant融合子产酸和遗传标稳定性测定液体摇瓶10-15次AJ11794（生长快，耗糖速率高3倍，发酵时间缩短1/3，L-Lys产量维持不变）Glu产生菌

AJ11638DECr（德夸香素）

KMr（酮丙二酸）对数期细胞A蛋白胨1%、酵母1%NaCl0.5%、蔗糖0.5%PH7.031.5℃Lys产生菌AJ11082（低葡萄糖消耗速率）AECr、CLLr、MLr、FPs、L-Ala-

对数期细胞

BProtoplantB悬浮于高渗溶液（pH10.5,0.1MCaCl2）第18页,共21页，2024年2月25日，星期天氨基酸的代谢控制与发酵（以Lys生产为例）重组DNA技术选育高产Lys菌株

Renerend将E.coli的Lys生物合成途径中Asp-β-半醛（ASA）脱氢酶，二氢吡啶2、6二羧酸（DDP或Ps）合成酶，PPP还原酶和二氨基庚二酸（DAP）脱羧酶的基因Asd,dapA,dapB,LysA从染色体上切下，分别连接到拷贝数高的质粒PBR322上，配制成杂种质粒PADIPDA1PDB2PLA17等