致病基因鉴定学年

致病基因鉴定学年

人类致病基因的鉴定

第2页,共149页，2024年2月25日，星期天

人类基因组计划之后，人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移，一个以基因组功能研究为主要内容的所谓“后基因组时代”(post-genomics)，即功能基因组(functionalgenomics)时代已开始。如何获取基因的功能信息，即与人类重大疾病和重要生理功能相关的基因信息，就摆在了我们面前。克隆疾病相关基因及基因的功能研究日益受到重视。第3页,共149页，2024年2月25日，星期天

所有人类致病基因将很快被定位在染色体的某个区域。这样，可从某局部的序列片段中筛选出致病基因进行结构与功能分析，也就是定位候选克隆及鉴定。

不是所有的基因都有鉴定的必要，只需要鉴定编码蛋白质的基因。这些基因被定义为一定会影响表现型，可能通过间接途径影响编码蛋白质基因的表达水平或是影响编码基因mRNA的加工和稳定性，引起表型的异常改变---遗传病。第4页,共149页，2024年2月25日，星期天

基因定位(genemapping)：

利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置上。1911年，Wilson将红绿色盲基因定位到X染色体。开创了人类基因定位的先河。1968年，Duffy将血型基因定位于1号染色体。首次在常染色体上进行的基因定位。基因克隆(genecloning)：用一定的方法把不同位点上的基因分离出来。第5页,共149页，2024年2月25日，星期天主要内容人类遗传病概述鉴定致病基因的原理和策略疾病基因克隆实例第6页,共149页，2024年2月25日，星期天一、人类遗传病的概述

遗传病(GeneticDisease)：是指遗传物质发生突变所引起的疾病，称为遗传病。特点：遗传物质突变；垂直传递；终生性。细胞核基因组遗传物质:

线粒体基因组第7页,共149页，2024年2月25日，星期天突变

生殖细胞（或受精卵）→遗传后代突变

体细胞：引起当代个体产生疾病,

不传下一代，体细胞→体细胞传递.

遗传病的发病既有遗传基础，又有环境因素，遗传因素提供了疾病产生的遗传背景，环境因素促使疾病表现出相应的症状和体症。二者作用的大小则要具体分析，如图。第8页,共149页，2024年2月25日，星期天第9页,共149页，2024年2月25日，星期天在了解遗传病概念的基础上，区别：1）遗传病与先天性疾病(Congenitaldisease)

先天性疾病是指出生时既表现出来的疾病。大多数遗传病都是先天的，出生前致病基因已经表达。而某些疾病在出生后并不表现，当发育到一定年龄Gene才表达，如成年型多囊肾病、脊髓小脑性共济失调，确实是遗传病。

某些先天畸形，如海豹式婴儿，反应停（Thalidomide）事件。第10页,共149页，2024年2月25日，星期天第11页,共149页，2024年2月25日，星期天

1962年，“反应停”在欧洲令1.2万名婴儿终身致残，4000多名患儿在一岁前夭折。

第12页,共149页，2024年2月25日，星期天2）遗传病与家族性疾病(Familialdisease)

大多数遗传病具有家族性，而某些散发性疾病确属遗传病，如某些AR，仅有先症者发病。第13页,共149页，2024年2月25日，星期天遗传病的主要类型

Thehereditarydisease'smaintype

从遗传学角度分类，遗传病包括：1、单基因病

涉及一对主基因所导致的疾病。

AR——先天聋哑

AD——并指、多指症

XR——红绿色盲

XD——抗VD佝偻病2、多基因病

涉及多对（二对以上）基因和环境共同作用所导致的疾病。如；唇裂、精神分裂症、高血压等。第14页,共149页，2024年2月25日，星期天3、染色体病

染色体异常引起的疾病。

数目异常常染色体——21三体综合征性染色体——Turner综合征结构异常常染色体——5p-，猫叫综合征性染色体——脆性X染色体综合征4、体细胞遗传病——肿瘤5、线粒体病——Leber视神经病（C核外基因组）第15页,共149页，2024年2月25日，星期天

一）染色体病Chromosomedisease

概念：由于染色体的数目、结构畸变所引起的疾病,称为染色体病。染色体是基因的载体，共有24种染色体：

包括1～22号常染色体和X、Y染色体，其中含有2～2.5万个基因、2.8х109bp(基因组)。最大的1号染色体约有250Mb，最小的21号染色体约有50Mb，可见一个染色体上有上千个基因。染色体除了DNA以外还有RNA、组蛋白、非组蛋白等组成。第16页,共149页，2024年2月25日，星期天染色体数目改变、微小结构畸变，都能引起许多基因增加或缺失，结果导致染色体异常综合征。染色体异常综合征的主要表现是:多发畸形、生长发育迟缓、智力低下，特征性皮纹改变等。目前记载已有100多种染色体综合征。第17页,共149页，2024年2月25日，星期天染色体异常的临床后果

自发流产在流产儿中进行染色体研究表明，大约50%或更多的自发流产儿有严重的染色体异常。几乎涉及到所有的染色体，但较为集中在某些染色体的改变。

如：X染色体、13、18、14、和21。

包括三体性、三倍体、四倍体、及单倍体等。第18页,共149页，2024年2月25日，星期天出生缺陷

染色体异常引起的第二大临床后果是出生缺陷，染色体的改变不同，临床表现也不尽相同。

但普遍的特点是：生长发育迟缓（growthretardation）智力低下（mentalretardation）特征性异常体征（specificsomaticabnormalities）

第19页,共149页，2024年2月25日，星期天

人类染色体：每一种生物都具有恒定的染色体数目和结构。一个体细胞中全部染色体组成就称为核型.

正常男性核型为正常女性核型为

46，XY

46，XX。第20页,共149页，2024年2月25日，星期天46,XY第21页,共149页，2024年2月25日，星期天46,XX第22页,共149页，2024年2月25日，星期天（一）染色体分析技术：

染色体显带技术

①

G显带---1971年建立，用胰蛋白酶处理后，Giemsa染色，可见深浅交替的带。

常规G显带：320～550条带。第23页,共149页，2024年2月25日，星期天显带方法：

G-显带：是最常用的方法。标本经胰蛋白酶处理后，应用Giemsa染色，镜检、分析,显示深染和浅染相间的带纹。第24页,共149页，2024年2月25日，星期天G-banding界标landmark区region带bands第25页,共149页，2024年2月25日，星期天

②Qbanding---1968年建立，用荧光染料处理后，在荧光显微镜下观察，可见明暗交替的带。③

Rbanding---盐溶液（磷酸二氢钠等）处理后，Giemsa染色，深浅带正好与G带相反。一般用于观察染色体末端。④Cbanding---用氢氧化钠或氢氧化钡预处理后，Giemsa染色，结构异染色质（着丝粒、副缢痕、Y染色体长臂等）染成深色。第26页,共149页，2024年2月25日，星期天染色体高分辨显带(highresolutionbandingchromosome,HRBC)：

70年代后期建立，一般显带是320条带，HRBC是550条带→850条→1000多条。在细胞分裂晚前期、早中期收集染色体，获得更长的染色体，然后显带。第27页,共149页，2024年2月25日，星期天第28页,共149页，2024年2月25日，星期天※

人类细胞遗传学研究新进展：（1）微细胞遗传学---应用HRBC技术研究染色体微细结构改变与遗传效应之间的相关性。一般能检测到4500Kb以上的DNA改变。（2）分子细胞遗传学---近年来进展快，应用较为广泛。以分子水平研究染色体结构畸变的遗传效应、疾病。第29页,共149页，2024年2月25日，星期天原位杂交----荧光原位杂交（FISH），把某一DNA片断（探针，基因）精确定位到染色体特定区带。染色体涂染---染色体特异性DNA作为探针池（某号染色体、或某区带染色体），用非同位素标记（如生物素），与靶细胞染色体进行原位杂交，以带有荧光的抗生物素蛋白进行抗原抗体反应后检测特异区段的荧光杂交信号。染色体易位检测时用两种不同染色涂染不同染色体。第30页,共149页，2024年2月25日，星期天1)单色FISH

第31页,共149页，2024年2月25日，星期天21-三体核型第32页,共149页，2024年2月25日，星期天21三体FISH诊断第33页,共149页，2024年2月25日，星期天

2)双色及多色FISH

应用1号（spectrumRed标记，红色）和12号染色体探针（spectrumGreen标记，绿色）进行双色FISH；

第34页,共149页，2024年2月25日，星期天应用10号（spectrumRed标记，红色）和2号染色体探针（spectrumGreen标记，绿色）进行双色FISH。第35页,共149页，2024年2月25日，星期天多色FISH（24种染色）第36页,共149页，2024年2月25日，星期天（二）染色体机能----转录活性和染色体结构之间的关系哺乳动物染色体有如下两个生物学功能：（1）保持遗传物质恒定---DNA复制后，经有丝分裂均分到子细胞中去。（2）世代传递来自于双亲的同源染色体之间发生互换（减数分裂），使遗传物质重组（父、母亲的），个体间差异。第37页,共149页，2024年2月25日，星期天染色体的机能依赖于着丝粒、端粒、复制起点三种元件，在酵母人工染色体的制备成功就说明这一点。

酵母人工染色体（Yestartificialchromosome,YAC）---具有相当于有功能的着丝粒、两个端粒、复制起点的特殊的克隆载体，能克隆200～2000Kb长度。

着丝粒---细胞分裂时姐妹染色单体之间分离，同源染色体之间分离起重要作用，没有着丝粒的染色体片断在分裂中丢失。有多个染色体特异的DNA序列组成，结构复杂。第38页,共149页，2024年2月25日，星期天

端粒---由DNA和蛋白质组成的特殊结构，位于真核生物染色体末端。其作用是：

①保持染色体的完整---失去端粒后染色体末端非常不稳定，容易与其他染色体切断形成的切端之间相接、融合形成易位染色体。端粒结合蛋白能识别端粒3’突出末端，起保护作用。②保证染色体末端DNA复制的完全，复制到DNA链终端。第39页,共149页，2024年2月25日，星期天③维持核内三维结构及对染色体配对起作用（染色体末端局限性存在于核周边）端粒的结构---进化过程中高度保守，由高度重复序列组成，在人类是由(TTAGGG)n组成，在端粒酶的作用下复制。端粒酶（telomerase）---由RNA和蛋白质组成的复合体，以核内RNA为模板合成DNA的反转录酶。细胞内以RNA为模板合成DNA，延伸端粒中富含TG的DNA领头链，以DNA聚合酶合成另一条链。因此，总是有3’突出单链末端，端粒的长度由遗传控制。第40页,共149页，2024年2月25日，星期天第41页,共149页，2024年2月25日，星期天

复制起点---

开始DNA复制的位点，维持染色体拷贝数。在哺乳动物数十个Kb间有个开始复制起点，由复制起始的特异序列组成。一个细胞周期只复制一次，即复制一次C分裂一次。转录活性与染色质/体结构相关---

细胞分裂间期染色质可以分为常染色质和异染色质，常染色质着色浅，螺旋化程度低，有转录活性。

第42页,共149页，2024年2月25日，星期天

功能异染色质异染色质

结构异染色质，X染色质属于功能异染色质，发育过程中选择性地凝缩形成。

结构异染色质是在各种细胞中总是处于凝缩状态，是高度重复的DNA，没有转录活性，常见于着丝粒、端粒，维持染色体的结构有关。目前FISH研究结果看到人类基因80%位于R带，仅有20%位于G带，CpG岛多数在R带。第43页,共149页，2024年2月25日，星期天X染色质属于功能异染色质第44页,共149页，2024年2月25日，星期天Lyon假说1.女性两条染色体中一条处于异固缩状态——X染色质（Barrbody）。2.胚胎发育早期—第16天开始异固缩。3.异固缩染色体是随机的。第45页,共149页，2024年2月25日，星期天需要说明的问题1）如果一个有缺失的X染色体，优先失活；2）常染色体和X染色体平衡易位的个体中，正常的X染色体优先失活；3）Xchr上的Gene不全部失活，约1/3的gene逃避失活，已知>16个基因逃避失活；4）体细胞X失活是永久的，但在生殖细胞发育中，失活是可逆的；5）C中只有一条X染色体有活性，其他均以失活状态存在；第46页,共149页，2024年2月25日，星期天

X染色体和Y染色体---

Y染色体上SRY基因（Yp11.3）决定男性性别，尽管有两个以上X染色体，但只要有Y染色体其表型为男性。X和Y染色体在减数分裂时配对，两者的短臂末端具有同源性，称为拟常染色质区，是减数分裂时配对的部位。第47页,共149页，2024年2月25日，星期天（三）染色体异常与疾病概念：由于染色体数目异常或结构异常引起的疾病就称为染色体病。数目异常：整倍体---染色体整组的变化，即3n、4n，常见于夭折的胚胎或肿瘤细胞中，这样的个体即使生下来也不能生存很长时间。非整倍体---不是整组的变化而是某号染色体增或减，2n+1,2n-1的改变。▲数目异常产生原因---染色体不分离，染色体丢失，核内复制，还有双受精。第48页,共149页，2024年2月25日，星期天染色体异常

数目异常：二倍体diploid

2n，一个体细胞中染色体数。46，XX。46，XY。整倍体euploid

n或n的倍数。23、46、69---非整倍体aneuploid

不是n或n的倍数。增加或减少1条或几条。三体性trisomy

某号染色体多一个拷贝，如21三体，47，XX，+21。单体性monosomy

某号染色体少一个拷贝，如Turner综合征，45，X。第49页,共149页，2024年2月25日，星期天三倍体形成原因：双雌受精和双雄受精23，X23，X23，X23，X23，X23，Y69,XXY69,XYY69,XXX69,XXY69,XXX23，X23，X23，X23，X23，X23，Y23，Y23，X23，YA.69,XXX的形成B.69,XXY的形成B.69,XYY的形成A.69,XXX的形成C.69,XXY的形成第50页,共149页，2024年2月25日，星期天四倍体形成原因：核内复制和核内有丝分裂第51页,共149页，2024年2月25日，星期天

非整倍体是不分离（non-disjunction）的结果，即在细胞分裂时染色体不能正常分开。

减数I不分离

减数分裂不分离不分离减数II不分离

有丝分裂不分离（卵裂不分离）第52页,共149页，2024年2月25日，星期天▲单亲二倍体：所有染色体（2n）来自父或母单方的二倍体。在胚胎时夭折，父源的就形成葡萄胎，母源的就形成卵巢畸胎瘤。

这是由于遗传印记，即父源的和母源的基因表达不同，二倍体都来自单亲的就不可能发育成个体。▲

单亲二体型：一对同源染色体都来自父或母方，一般三体型丢失一条后其数目正常，但都来自于单亲。第53页,共149页，2024年2月25日，星期天

常染色体病染色体病：性染色体病

常染色体病---由于常染色体数目和结构异常引起的病，最常见的是唐氏综合症（Downsyndrome,DS，21三体，先天愚型）。

第54页,共149页，2024年2月25日，星期天

DownSyndrome第55页,共149页，2024年2月25日，星期天Down（唐氏）综合征患者第56页,共149页，2024年2月25日，星期天3）核型第57页,共149页，2024年2月25日，星期天性染色体病---

由于性染色体数目或结构异常引起的疾病。最常见的是：Turner综合症

45,XKlinfilter综合症47,XXY其次是脆性X染色体综合症第58页,共149页，2024年2月25日，星期天Klinfilter综合征47,XXY第59页,共149页，2024年2月25日，星期天Turner综合征45,X第60页,共149页，2024年2月25日，星期天结构异常：染色体断裂以后形成的断片变位重接就产生各种结构异常。包括缺失、重复、倒位、易位、插入、环状染色体、双着丝粒染色体等。一般4Mb以上的改变才能被识别（光镜下）。染色体结构异常类型：第61页,共149页，2024年2月25日，星期天1、缺失deletion-del2、易位translocation-t相互易位罗伯逊易位Robertsoniantranslocation-rob3、等臂染色体isochromosome-iso4、插入insersion-ins5、倒位inversion-inv6、重复duplication-dup7、双着丝粒染色体dicentricchromosome-dic8、环状染色体ringchromosome–r

第62页,共149页，2024年2月25日，星期天第63页,共149页，2024年2月25日，星期天双着丝粒染色体dicentricchromosome-dic第64页,共149页，2024年2月25日，星期天环状染色体ringchromosome-r第65页,共149页，2024年2月25日，星期天脆性X染色体综合征（fragileXchromosome，fraX）

位于Xq27.3处染色体呈细丝样，易断裂—脆性部位。该病主要男性发病，发病率高（仅次于21三体），发病率为男性的1/1250。临床症状—智力低下（中度），头大，长脸，下颌大，大耳，大睾丸，语言障碍。近年分子遗传学研究进展：克隆分离FMRIgene（主要在脑中表达），Xq27.3，38kb，17个外显子。第66页,共149页，2024年2月25日，星期天第67页,共149页，2024年2月25日，星期天第68页,共149页，2024年2月25日，星期天脆性X染色体综合征家系第69页,共149页，2024年2月25日，星期天发病机制：5′端第1外显子非编码顺序中存在（CGG）n。正常状态：

n=6～46，当n〉52减数分裂时不稳定，传递过程中重复拷贝数增加。前突变（premutation）：n=60～2005′端非甲基化，无临床表现（携带者）。第70页,共149页，2024年2月25日，星期天突变：当n〉230，达数百，数千，有临床症状

5′端高度甲基化不稳定

转录停止不同细胞中n数不同无FMR1mRNA及蛋白嵌合体第71页,共149页，2024年2月25日，星期天携带者：大部分是n=50～230（前突变）

FMR1仍有表达，但传递时不稳定，尤其母亲更不稳定

子女

当n〈70突变概率20%n〉90突变概率99%

女性的突变主要由母亲前突变传来，而不是父亲，在家系传递过程中，拷贝数逐渐增多，表现为遗传早现，即随着传代发病年龄提早，病情加重。第72页,共149页，2024年2月25日，星期天第73页,共149页，2024年2月25日，星期天第74页,共149页，2024年2月25日，星期天第75页,共149页，2024年2月25日，星期天二）单基因病

（monogenicdisease）

的分子生物学

1.单基因遗传病的概念、种类：

由一对主基因所决定的性状或疾病称为单基因遗传病。目前已知约有6000多种，其中约3000多种与疾病相关。根据基因的显、隐性，位于1～22号常染色体上还是X染色体上，把单基因遗传病分为如下4种：第76页,共149页，2024年2月25日，星期天AD---占半数以上，一般来讲结构蛋白异常，包括完全显性、不完全显性、共显性、不规则显性、延迟显性。AR---约占36%，一般是酶蛋白异常。XR---10%以下。XD---较少第77页,共149页，2024年2月25日，星期天常染色体显性遗传（AD）例1：Huntingtondisease（HD）

亨廷顿舞蹈症是一种遗传神经退化疾病，主要病因是患者HD基因发生变异，产生了变异的蛋白质，该蛋白质在细胞内逐渐聚集，形成大的分子团。

杂合体多在30—40岁发病，致病基因定位于4p16.3。正常n=25～39分子机制，（CAG）n扩展

患者n=42～81第78页,共149页，2024年2月25日，星期天

例2：脊髓小脑共济失调

(Spinocerebellarataxias,SCAs)

神经退化性疾病,AD

临床症状—迟发性共济失调，走路不稳，易跌，步态蹒跚，两手笨拙，震颤，不能精细动作；喝水呛；构音障碍，眼震颤等。

SCA已发现有20几种亚型—基因座异质性发病机制与三核苷酸重复扩展的动态突变相关。例如：SCA1基因编码区5′端（CAG）n

正常：n=17～36

发病:n〉43第79页,共149页，2024年2月25日，星期天ⅠⅡⅢⅣⅤ60岁发病70岁死亡121231234567891066岁死亡45岁发病62岁死亡50岁发病56岁死亡45岁发病26岁死亡19岁发病1234567891011121314151617181920212223242526272812345678910111213141565岁50岁发病48岁36岁发病36岁因肺结核死亡

常染色体显性脊髓小脑共济失调（SCA）家系系谱

1遗传方式：AD。2延迟显性:V代15个子女无一发病。

3早现遗传：Ⅱ（36岁）>Ⅲ（>

45岁）2、4、5。4遗传印记：Ⅲ5(男)后代患病多，Ⅲ4（女）后代患病少。第80页,共149页，2024年2月25日，星期天动态突变（dynamicmutation）:

某些遗传性疾病与三核苷酸重复拷贝数的扩展有关，三核苷酸重复拷贝数在正常情况下有一定的变异范围，而扩展时就表现为疾病，这种突变不稳定，其拷贝数与病情正相关。例如：强直性肌营养不良症（CTG）n，3′非编码区。脆性X染色体综合征（CGG）n，

5′非编码区。

HD（CAG）n，

5′编码区。

SCA（CAG）n，

5′编码区。第81页,共149页，2024年2月25日，星期天

HD早现遗传（anticipation）：一些遗传病表现出连续世代传递中发病年龄提早，病情也加重，这种现象就称为早现遗传。这与动态突变中三核苷酸拷贝数的扩展程度有关。

父亲遗传—发病早（20岁以前）HD----病情严重

母亲遗传—约在40岁以后发病，

----病情较轻第82页,共149页，2024年2月25日，星期天遗传印迹（Geneticimprinting）：

双亲的基因或染色体存在功能上的差异，因而基因来自父方或母方而产生不同表现型的现象。这是由于生殖细胞分化过程中受到不同修饰的结果。例如：15p11-13缺失

父源染色体缺失—Prader-will综合征母源染色体缺失—Angelman综合征第83页,共149页，2024年2月25日，星期天※

分子病以及先天性代谢病：

分子病（moleculaerdisease）的概念是1949年Pauling首次提出，对HbS患者的血红蛋白进行电泳检测时发现，患者和正常人的Hb泳动速度不同，考虑是由于Hb的分子结构不同所致，由此提出分子病的概念。第84页,共149页，2024年2月25日，星期天分子病包括：血红蛋白病----异常血红蛋白病（结构异常）约有600多种地中海贫血（合成速率下降）包括α地贫和β地贫。血浆蛋白异常免疫蛋白异常受体蛋白异常酶蛋白异常---先天性代谢病第85页,共149页，2024年2月25日，星期天先天性代谢病:遗传性酶缺陷导致代谢异常。基因缺陷→酶蛋白异常→代谢异常→疾病.

例如：苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxyrase,PAH）遗传性缺陷所致，AR,12q24,发病率为1/16500，由于PAH基因缺陷苯丙氨酸代谢受阻，导致旁路代谢开放副产物累积，造成白化症（酪氨酸缺乏），苯丙酮尿，智力低下（脑脊液中含有大量的苯丙酮酸等中间代谢产物，使智力发育受限）。第86页,共149页，2024年2月25日，星期天2.

X-连锁隐性遗传病：常见的有：

血友病

DMDG6PD

红绿色盲等。第87页,共149页，2024年2月25日，星期天血友病(hemophiliaA)

以血友病为例介绍疾病的认识过程及疾病的分子生物学研究过程。血友病是分子遗传学研究基因定位、基因诊断、基因治疗中很有意义的疾病.早在二世纪被犹太人注意12世纪在阿拉伯文献中有记载。19世纪已注意到出血不止的原因是由于凝血缓慢。第88页,共149页，2024年2月25日，星期天

1）

19世纪历史上最著名的血友病家系---

英国王室出现的血友病，波及欧洲各王室。

Victoria女王（1820~1901），8岁时其父去世，被定为王位继承者，其父母家系中无血友病病史，后来研究认为是新生的突变。她共生育8个子女，三个儿子中一个是血友病患者，五个女儿中两个是携带者，她们的女儿分别嫁到俄罗斯、德国、西班牙等多个欧洲国家。以后生了血友病儿子。结果现今英女王是Vctoria正常儿子的后裔，因此其后代中无血友病患者，英国王室不再受血友病之害。然而通过携带者女儿把血友病传递到欧洲多个王室。第89页,共149页，2024年2月25日，星期天“Royaldisease”

第90页,共149页，2024年2月25日，星期天2）

20世纪Mendel遗传规律的应用----

发现血友病是XR,男性患者，女性携带者。3）1911~1937年----

探索血友病凝血缺陷的早期努力。

通过临床实验发现血友病患者的血液----凝血时间延长，但不清楚是凝血第几因子的缺乏。4）1950~1983年----

命名因子Ⅷ，并分离出来。第91页,共149页，2024年2月25日，星期天1962年,明确A型是第Ⅷ因子缺乏，B型是第Ⅸ因子缺乏所致。血友病中5/6是A型，1/6是其他因子缺乏，其中主要是B型。※1965年取得很大进展凝血瀑布假说----FⅧ是一个辅助因子，凝血过程中FⅧ增强了FⅨa因子对FⅩ因子激活的作用，可见在临床上A型与B型无法区别。

第92页,共149页，2024年2月25日，星期天血液凝固的级联式过程第93页,共149页，2024年2月25日，星期天※

FⅧ因子和血管性假血友病(vonwillebrand’sdisease,VWD)

VWD是由于VWF（Vonwillebrand’sfactor,血管性假血友病因子）缺乏所致。

VWD是50年代首先被描写的常染色体显性遗传病，是由于VWF遗传性缺陷所致。第94页,共149页，2024年2月25日，星期天

VWF—已证明是FⅧ的受体，血浆中FⅧ是大分子复合物—即小分子量部分的FⅧ促凝活性和大分子量部分的VWF两者结合所组成。FⅧ促凝活性（Ⅷ：C）缺乏是血友病A的发病原因，FⅧ促凝活性只占FⅧ复合物中的1%，具有凝血活性作用，血浆中含量约为50μg/L。Ⅷ：C的正常值为50～150%，小于正常的2%为重型，正常的2～5%为中型，正常的5～25%标记为轻型，正常的25～50%为亚临床型。VWF基因定位于12P12～Pter,VWD是AD遗传。1979年才把FⅧ和VWF纯化出来。第95页,共149页，2024年2月25日，星期天血友病的治疗---人的血浆中FⅧ含量低，因此在动物（猪、牛）血中提取,输给患者，可能产生抗体，诱发其他病，但是救了许多生命。即血浆化学分离，商品化，问题是出现了并发症，乙肝病毒、艾滋病病毒感染。1979年～1983年之间大部分FⅧ提取物被污染上了HIV，对于血友病的治疗是悲剧性的结果。后来用灭活这些病毒的方法有了些好转。第96页,共149页，2024年2月25日，星期天5）

1982年~1984年血浆提纯

FⅧ提取高纯度的FⅧ而获得专利，随后设想能否用生物工程的方法制备FⅧ，既提高产量也可以避免病毒等污染。第97页,共149页，2024年2月25日，星期天几个研究小组同时进行研究：

把纯化的FⅧ经胰蛋白酶消化成不同的多肽片断，通过色谱法分离不同多肽片断，将多肽片断进行氨基酸测序，以此为依据设计合成相应的寡核苷酸探针（考虑密码的兼并性），应用此探针筛选基因组文库，再经基因组文库步移法克隆全基因。基因全长为186Kb,含26个外显子。用如上探针筛选肝脏的cDNA文库，就能得到FⅧ基因的cDNA。第98页,共149页，2024年2月25日，星期天1984年12月在Nature杂志上发表了如上研究结果。然后把FⅧcDNA克隆于表达载体，研究分析基因和蛋白质的结构与功能。FⅧ基因：位于Xq28,全长186Kb,占X染色体的0.1%,含有26个外显子和25个内含子，其中第22内含子长达32Kb.mRNA9.0Kb。第99页,共149页，2024年2月25日，星期天FⅧ蛋白：由cDNA推测的FⅧ蛋白---含19个aa的信号肽和2332aa组成，主要在肝脏中合成，分泌时信号肽断开后成为成熟的氨基末端，由A1A2BA3C1C2

等区域构成(同源性来分)。C区域---FⅧ功能区，B区域---由外显子14编码，与已知蛋白不同源，在活化的FⅧ中被剪切掉B区域，推测可能是被加工后的mRNA反转录后再整合进去的。第100页,共149页，2024年2月25日，星期天第101页,共149页，2024年2月25日，星期天6）如何检测血友病携带者血液中FⅧ水平能检测大多数携带者，但携带者可以有正常的FⅧ水平，最好的方法是基因诊断。1987年首次应用RFLP连锁分析进行了首例产前基因诊断。第102页,共149页，2024年2月25日，星期天

奥大利亚一位医生的妻子是个血友病携带者（家族性），当他阅读了《Nature》杂志上发表的论文后，来信恳求作产前基因诊断.经过BclⅠ/RFLP连锁分析，确定胎儿是正常男性（核型分析判断性别为男性），连锁分析判断未得到带有致病基因的染色体，其结果发表在Lancent杂志上。第103页,共149页，2024年2月25日，星期天

内含子18中BclⅠ多态,Southern杂交分析结果：1.2Kb(1165bp)占27%，

0.9Kb(879bp)占73%，杂合子频率:2pq=2×0.27×0.73=0.42(一般在RFLP的情况下小于0.5)。第104页,共149页，2024年2月25日，星期天BCLI多态第105页,共149页，2024年2月25日，星期天7）1986年首次检测引起甲型血友病的点突变

TaqⅠ/RFLPSouthern检测（以cDNA为探针）结果，患者出现异常带，进一步克隆测序判定，外显子24中密码子2209的CGA→TGA,结果精氨酸变成了终止密码。（迄今已发现80多种点突变、6种插入、7种小缺失、及60多种大缺失。）

第106页,共149页，2024年2月25日，星期天8)1987～1992年

PCR技术的应用，检测到很多种突变，也检测到多种多态。

9）1992年缺失检测。

10）神秘的内含子22被阐明，其中有2个小基因，分别叫F8A和F8B，通过CpG岛发现，其功能还没有搞清楚，已被检测到的蛋白质中没有与该基因阅读框架相应的蛋白质。第107页,共149页，2024年2月25日，星期天11）1990年～1993年

通过基因工程技术生产FⅧ---将FⅧ基因重组于表达载体，把重组体转染到BHK细胞中表达，使其产生FⅧ，1～2mg/升。首先在狗中做实验，然后用于人。第一批接受治疗的严重血友病患者，其止血效果非常好，没有发现明显的不良表现，但后来注意到几乎30%的人产生抗体。目前市售的FⅧ有---血浆来源的FⅧ或FⅧ复合物、基因工程生产的。第108页,共149页，2024年2月25日，星期天12）1995年~2002年①

确定所有突变基因型，又有效阻止这些突变②

推动基因治疗③

解答蛋白产物的三维结构④

阐明蛋白功能的机制，研究基因的进化上述为认识遗传病的过程。

第109页,共149页，2024年2月25日，星期天假肥大型肌营养不良：

包括DMD（Duchennemusculardystrophy）,和BMD（Beckermusculardystrophy）,都是DMD基因缺陷所致，DMD比BMD症状重，发病年龄早。DMD发病率为1/3500，是神经肌肉系统最常见的遗传病，XR遗传。一般5～6岁开始发病，双下肢无力，上楼梯困难，Gower征（+），腓肠肌假性肥大，进行性肌萎缩，10岁以后不能自主走路，20岁前死于呼吸、循环衰竭。第110页,共149页，2024年2月25日，星期天

部分患儿伴有不同程度的智力低下。生化检测---血清磷酸激酶（CPK）升高,

乳酸脱氢酶（LDH）升高,

肌红蛋白（Mb）升高。肌电图---呈典型肌源性疾病改变。第111页,共149页，2024年2月25日，星期天二、鉴定致病基因的原理和策略

人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移。一个以基因组功能研究为主要内容的所谓“后基因组时代”(post-genomics)，也即功能基因组(functionalgenomics)时代已开始。重要的是如何获取基因的功能信息，即与人类重大疾病和重要生理功能相关的基因信息，所以克隆疾病相关基因及基因的功能研究日益受到重视。第112页,共149页，2024年2月25日，星期天

在人类基因组测序完成前，基因克隆的两个基本方法是功能克隆和位置/定位克隆。而在人类基因组测序完成后，阐明具体的基因功能变得更加重要，基于家系的资料阐述基因功能和疾病基因组学研究还是具有不可取代的价值。多方法可以完成对致病基因的最后的识别,但所有的途径都集中于一个候选基因。通过某种方法鉴定一种候选基因，接着通过在患者中筛选阳性克隆验证这是致病基因的假说。

有机体模型→数据库调查→临床输入→实验室工作→成功。第113页,共149页，2024年2月25日，星期天一）表达基因的克隆策略

基因克隆(genecloning)：是指从基因组或DNA大片段中分离并获得某一特定的基因或DNA序列，再通过DNA序列扩增形成由众多拷贝组成的一个DNA片段群体的过程。目前，广泛应用于致病基因分离与克隆的策略可归纳为：定位克隆(positionalcloning)、功能克隆(Functionalcloning)、候选位置克隆(candidatepositionalcloning)等。第114页,共149页，2024年2月25日，星期天1、定位克隆(positionalcloning)

定位克隆是先利用连锁分析进行基因定位作图，然后进行基因克隆，进一步明确该基因的功能。

分析患病家系的连锁关系确定致病基因的遗传方式，从染色体畸变引发的疾病入手，将染色体畸变的位置作为疾病基因克隆的一个位点进行分析的一种克隆策略。总体思路是：

疾病——染色体定位——基因序列——mRNA／cDNA—

蛋白质(致病基因产物)。第115页,共149页，2024年2月25日，星期天定位克隆疾病相关基因的常规流程ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMetValSerLeuGlnProMetValSerLeuStop全基因组扫描基因测序精细定位确定候选基因家系研究染色体位点候选基因第116页,共149页，2024年2月25日，星期天伴随人类基因组计划的实施而发展起来的基因定位新策略。其他信息未知的情况下先染色体定位，然后进行克隆。

染色体定位→缩小候选区域→邻近克隆群中筛选出结构基因→经筛查突变来确定疾病相关基因。第117页,共149页，2024年2月25日，星期天1）

染色体定位的方法（范围较大，通常大于10Mb）（1）

连锁分析---遗传病的基因定位常用方法。通过家系分析寻找lod值3以上的遗传标记，此标记位点就是该基因的候选区域。（2）杂合性丢失筛选(lossofheterozygosity,LOH)

常用于肿瘤抑制基因的定位。应用微卫星多态标记（一般经过细胞遗传学分析，染色体缺失好发部位的多态标记），对比正常组织与肿瘤组织，寻找肿瘤中好发杂合性丢失部位（图）。第118页,共149页，2024年2月25日，星期天11925个遗传标记---10个病例第119页,共149页，2024年2月25日，星期天（3）染色体异常---在一些疾病中伴随着染色体异常，此异常部位的基因与疾病相关。例如，DMD中常见到Xp21缺失或该点的易位。1986年成功报道了DMD基因的定位克隆例子。（此外还有CF、HD、多囊肾、大肠癌、乳腺癌等致病基因），这种方法很费事，到1995年末只有50多个基因用此法进行克隆。第120页,共149页，2024年2月25日，星期天

2)缩小候选区域---

缩小候选染色体区域的范围，用多态性标记对该区域作更为精细的遗传图，在这个过程中遗传分析至关重要，采取交换体分析、连锁不平衡分析等方法尽可能缩小染色体区域定位。第121页,共149页，2024年2月25日，星期天3)克隆重叠群(clonecontugs)的连接及筛选目的基因转录图构建,克隆DNA中识别基因.主要用CpG岛识别、外显子捕获、DNA测序等方法（寻找外显子序列特征部分）。4)突变筛查确定候选基因(致病基因)※三个定位克隆的成功例子（DMD、NF1、CF）。第122页,共149页，2024年2月25日，星期天2、功能克隆（Functionalcloning）

功能克隆：是利用已知性状对应的基因产物，如蛋白质氨基酸序列的信息，进行基因定位，进而克隆该基因。用该方法克隆基因，需要预先得知性状对应的蛋白质序列。利用其mRNA反转录成cDNA，再用cDNA作探针从人类基因组中钓出基因本身。

蛋白质→RNA→DNA/GENE

第123页,共149页，2024年2月25日，星期天3、候选基因法（canidategeneapproach）

候选基因法无需经过基因图和物理图的过程，而根据某种遗传病和特定基因分别定位于染色体的同一区域，而后在发现并鉴定其基因突变，则可研究此致病基因。假设某一基因为候选基因——用证据验证假设。这种策略的优点在于把候选基因产物与疾病病理之间相关性作为基础，提出候选基因。1）从基因表达及机能推测候选基因：例如:胚胎发育过程中神经管形成，在发育３～４周阶段，表达的基因与神经管形成相关-----神经管形成候选基因。第124页,共149页，2024年2月25日，星期天

２）应用疾病动物模型――动物中相关基因已知的情况下，分析人类疾病相关基因（同源基因）３）相似的人类疾病基因序列同源性和机能相关性分析――例如:某一基因属于某一多基因家族。４）最有力的候选基因是那些定位于疾病基因同样染色体区段的基因。某一候选基因的位置正好与该疾病在染色体上定位点相一致。第125页,共149页，2024年2月25日，星期天４．突变筛查-------确定候选基因候选基因→患者中该基因存在突变→才能确定。大量患者、大量正常人要进行对比检查。

第126页,共149页，2024年2月25日，星期天二）确定表达基因序列的技术方法1、连锁分析与致病基因定位当染色体上控制这些性状的基因位点相距很近时，在减数分裂过程中位点之间发生染色体单体交叉和等位基因互换的机率较小，相邻的基因位点就有较大的机会以连锁方式传递给后代，即两位点越近，发生染色体交叉和基因重组的可能性越小，反之越大。位点间的距离用重组率或重组分数(recombinationfraction.)进行估计。即：重组分数＝重组配子数/（重组配子数＋非重组配子数）第127页,共149页，2024年2月25日，星期天2、利用染色体畸变进行基因定位与分离

若发现某种疾病与染色体畸变直接相关，致病基因就可定位在一段相对较短的染色体变异区域。通过连锁分析将基因分离的目标初步定位在10～20Mb区段内，使要分离的目标基因大大缩小，省去了大量繁琐的全基因组连锁分析，大大加快了该基因的定位和分离速度。通过筛选DNA文库、外显子捕获(exontrapping)和比较基因组杂交(comparativegenomehybridizatien)等表型策略获得致病基因。第128页,共149页，2024年2月25日，星期天3、cDNA选择法

基因组图谱绘制和基因定位克隆的常见问题是大片段基因组编码DNA的鉴定。为解决此问题，1991年，Parimoos等首先提出了cDNA选择法。

此法采用cDNA片段与固定在膜上的DNA进行杂交，通过PCR回收候选cDNA。用YAC、粘粒克隆扩增cDNA，进行基因组DNA大片段编码序列的迅速克隆。

第129页,共149页，2024年2月25日，星期天第130页,共149页，2024年2月25日，星期天4、CpG岛法

CpG岛(CpGisland)是基因组DNA序列中富含C-G的DNA区域。在大规模的DNA测序中，每发现一个CG岛，意味着在此有一个基因。利用CpG岛稀有酶如SacⅡ、BssHⅢ、EagⅠ、HpaⅡ、NotⅠ识别其位点，切割基因组DNA。CpG岛又称HIF岛，即用HpaⅡ酶将CpG岛周围的DNA切成许多小片段，这些序列称为HIF序列。

用位于CpG附近的序列作探针，从总DNA文库或cDNA文库中得到转录子，鉴定表达基因。

第131页,共149页，2024年2月25日，星期天CpGisland第132页,共149页，2024年2月25日，星期天CPG预测及引物设计第133页,共149页，2024年2月25日，星期天5、基因表达序列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)

VelculescuVE等(1995)率先提出的一种分析基因表达的新策略，其主要特点是能在短期内采用PCR或手动测序等通用仪器得到大量的表达信息，并能对不同状态下的表达基因进行定量和定性的检测，比较完整地直接读出基因表达的信息。因此，SAGE技术在研究表达基因测序上有较大的发展潜力。与cDNA选择法相比，基因序列表达分析能减少大量的重复测序，大大节省研究时间和费用。第134页,共149页，2024年2月25日，星期天6、动物基因组印迹杂交

动物基因组印迹杂交(Zooblot)是基于人类及其他动物在长期进化中普遍存在基因的同源和保守序列的理论设计的。该方法采用同一基因单拷贝的分子探针与各种动物的基因组DNA作Southern印迹杂交筛选，如果杂交表现为阳性，表明所用的探针中可能包含进化过程中的保守序列，即序列间有很高的同源性，该序列可能是外显子或编码表达基因区域，进而分离基因组中的表达序列。鉴定整个基因→分离相应cDNA\mRNA→鉴定蛋白。第135页,共149页，2024年2月25日，星期天通过Zoo-Blotting，cDNA杂交，

基因组杂交