选修微生物的实验室培养课件

选修微生物的实验室培养课件微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基础知识第2页,共65页，2024年2月25日，星期天细菌的外形与大小细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察图1-1常见的三种细菌典型形态A.球菌B.杆菌C.弧菌第3页,共65页，2024年2月25日，星期天细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。细菌的构造图1-3细菌的结构第4页,共65页，2024年2月25日，星期天*细胞壁结构特点：坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？①固定细胞外形；

②保护细胞免受外力的损伤；

③阻拦大分子物质进人细胞；④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。伤寒杆菌细胞壁中含毒素第5页,共65页，2024年2月25日，星期天芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.第6页,共65页，2024年2月25日，星期天菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。第7页,共65页，2024年2月25日，星期天菌落细菌的菌落特征因种而异第8页,共65页，2024年2月25日，星期天放线菌1、结构：单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）第9页,共65页，2024年2月25日，星期天链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素

微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的

应用:第10页,共65页，2024年2月25日，星期天病毒的结构第11页,共65页，2024年2月25日，星期天病毒

第12页,共65页，2024年2月25日，星期天SARS病毒、禽流感病毒第13页,共65页，2024年2月25日，星期天朊病毒（蛋白质病毒）第14页,共65页，2024年2月25日，星期天2、病毒的增殖：第15页,共65页，2024年2月25日，星期天真菌第16页,共65页，2024年2月25日，星期天如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构酵母菌和霉菌青霉第17页,共65页，2024年2月25日，星期天生殖直立菌丝营养菌丝腐生生活孢子生殖第18页,共65页，2024年2月25日，星期天细菌的营养类型根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。自养菌（autotroph）异养菌（heterotroph）腐生菌寄生菌大部分病原菌第19页,共65页，2024年2月25日，星期天第20页,共65页，2024年2月25日，星期天课题1微生物的实验室培养

培养基1．概念营养物质

人们按照微生物对____________的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。第21页,共65页，2024年2月25日，星期天2．营养构成碳源特殊营养物质

(1)一般都含有水、__________、氮源、无机盐。

(2)还要满足微生物生长对pH、________________以及O2的要求。

3．分类

(1)液体培养基：配制成的液体状态的基质。

(2)固体培养基：配制成的固体状态的基质，在液体培养基中加入凝固剂，如琼脂，制成琼脂固体培养基。第22页,共65页，2024年2月25日，星期天无菌技术1．消毒温和巴氏

(1)特点：使用较为________的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。

(2)常用方法：煮沸消毒法、________消毒法、化学药剂消毒法。2．灭菌强烈灼烧

(1)特点：使用________的理化因素杀死物体内外所有的微生物。

(2)常用方法：________灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。第23页,共65页，2024年2月25日，星期天微生物培养的基本技术1．配制培养基称量―→混合―→溶化―→调pH―→分装―→包扎2．灭菌加水―→加培养基―→密封―→排冷气―→维持压力―→取出倒平板(或搁置斜面)第24页,共65页，2024年2月25日，星期天3．接种稀释涂布平板(1)接种过程：洗净双手→点燃酒精灯→接种→贴标签。(2)接种工具：包括____________、涂布器。接种环(3)接种方法：平板划线法、____________________法。(4)注意事项：整个操作过程要在____________旁完成。4．培养酒精灯火焰接种后的培养皿放入恒温箱内培养。第25页,共65页，2024年2月25日，星期天菌种保藏1．临时保藏固体斜面4℃

(1)操作： 采用______________培养基，菌落长成后，放入______冰箱中保藏，以后每3～6个月，转移一次新的培养基。

(2)缺点： 保存时间不长，菌种易被污染或产生变异。2．长期保存法甘油管藏采用________________法，放入－20℃的冷冻箱中保存。第26页,共65页，2024年2月25日，星期天营养物质定义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质合成生物体的细胞物质和一些代谢产物；有些是异养生物的能源物质①无机化合物：CO2、NaHCO3

等。②有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物①无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐。②有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等微生物的营养要素1．微生物的营养物质及功能第27页,共65页，2024年2月25日，星期天了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。

一、课题目标：掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：三、技能目标：第28页,共65页，2024年2月25日，星期天一、基础知识：（一）培养基

培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途第29页,共65页，2024年2月25日，星期天2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方

(参考教材附录内容)

3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。第30页,共65页，2024年2月25日，星期天选择培养基加入青霉素的培养基:

分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:

分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:

分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:

分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:

分离杂交瘤细胞第31页,共65页，2024年2月25日，星期天

根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:第32页,共65页，2024年2月25日，星期天天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;天然培养基：第33页,共65页，2024年2月25日，星期天血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分

人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。第34页,共65页，2024年2月25日，星期天液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长第35页,共65页，2024年2月25日，星期天固体培养基：菌落，菌苔第36页,共65页，2024年2月25日，星期天半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)

第37页,共65页，2024年2月25日，星期天4.培养基的用途液体培养基：增菌固体培养基：纯化，增菌半固体培养基：动力检测，保种第38页,共65页，2024年2月25日，星期天（二）无菌技术1.无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。第39页,共65页，2024年2月25日，星期天

（１）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒（High-levelDisinfection）、中程度消毒（Intermediate-levelDisinfection）、低程度消毒（Low-levelDisinfection）三种方式。2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

第40页,共65页，2024年2月25日，星期天

（2）灭菌的定义：

以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。

灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。第41页,共65页，2024年2月25日，星期天1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法第42页,共65页，2024年2月25日，星期天1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.(2)灭菌的方法：第43页,共65页，2024年2月25日，星期天

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

第44页,共65页，2024年2月25日，星期天分类定义方法灭菌法杀灭一切微生物物理法：热力、辐射、微波、等离子体化学法：醛类、烷化剂高效消毒法杀灭一切致病微生物紫外线、含氯剂、臭氧、复配剂等中效消毒法杀灭除芽孢外的致病微生物超声波、碘类、醇类、酚类低效消毒法杀灭细菌繁殖体、亲脂病毒单链季胺盐、双胍类、中草药、金属离子无菌技术第45页,共65页，2024年2月25日，星期天3.微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存第46页,共65页，2024年2月25日，星期天1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考第47页,共65页，2024年2月25日，星期天三、实验操作

1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）第48页,共65页，2024年2月25日，星期天1．计算、称量2．溶化3．调pH：pH7．6

4．过滤：这一步可以省去。5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6．加塞7．包扎操作步骤第49页,共65页，2024年2月25日，星期天8．灭菌:

将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。9．倒平板:

待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。第50页,共65页，2024年2月25日，星期天倒平板技术第51页,共65页，2024年2月25日，星期天1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。第52页,共65页，2024年2月25日，星期天3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第53页,共65页，2024年2月25日，星期天2、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法

平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术第54页,共65页，2024年2月25日，星期天第55页,共65页，2024年2月25日，星期天第56页,共65页，2024年2月25日，星期天问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第57页,共65页，2024年2月25日，星期天

2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数