重组基因导入受体细胞

重组基因导入受体细胞作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性：便于重组DNA分子的导入；能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；便于重组体的筛选；遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。在遗传密码的应用上无明显偏倚性；具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。第2页,共68页，2024年2月25日，星期天关于细菌的感受态本质与存在局部原生质体化假说——细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。酶受体假说——感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞。通常制备高效转化的感受态细胞的方法是：在冰浴中，用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌。

CaCl2处理后的细菌一般4℃可保存48h,用于转化，大多数能在1-2天内具有吸收外源DNA的能力。第3页,共68页，2024年2月25日，星期天重组体分子导入受体细胞的途径将外源重组体分子导入受体细胞的途包括转化、转染、转导、显微注射、电穿孔等多种方式。这些途径将随载体种类和受体系统的不同而异。转化和转导主要适应于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔主要应用于高等动植物的真核细胞。

把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程称为转化（transformation）。将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程称为转染（transfection）。若重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞中，这一过程称为转导（transduction）。第4页,共68页，2024年2月25日，星期天转化反应DNA分子转化的过程如下：1.吸附——完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面；2.转化——双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌，另一链降解；3.自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA；4.表达——供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。有的实验结果表明，进行转化的是双链DNA，有的则证明吸附在细胞表面的是双链DNA,但是以单链DNA进入细胞。至于质粒DNA转化质粒构型的关系，认为只有闭环DNA与开环DNA的转化，才能获得转化子，而线性质粒DNA进行转化不能得到转化子，因为用超螺旋闭合环状和开环质粒转化大肠杆菌不会受到菌体酶的破坏。第5页,共68页，2024年2月25日，星期天基因工程中常用的受体细胞类型：原核生物细胞真核生物细胞真菌细胞植物细胞动物细胞第6页,共68页，2024年2月25日，星期天一、原核生物细胞优点：大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。第7页,共68页，2024年2月25日，星期天缺点：原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。第8页,共68页，2024年2月25日，星期天

至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。(一)大肠杆菌受体细胞大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。第9页,共68页，2024年2月25日，星期天(二)枯草杆菌受体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。优点：枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。第10页,共68页，2024年2月25日，星期天(三)蓝细菌（蓝藻）蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ(PSⅠ)

和光合系统Ⅱ(PSⅡ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。细胞壁属G-，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。第11页,共68页，2024年2月25日，星期天二、丝状真菌受体细胞

霉菌的基因结构、表达调控机理，以及蛋白质加工与分泌都具有真核生物的特征，利用其表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。霉菌培养条件简单，可以大规模培养；霉菌可以分泌表达目的基因产物，大大简化目标产物的分离纯化过程。第12页,共68页，2024年2月25日，星期天三、酵母菌细胞是单细胞真核微生物，外源真核基因理想的表达系统。优点：酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对比较简单。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。不含有特异性病毒，不产生毒素。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。能使外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工。第13页,共68页，2024年2月25日，星期天四、植物受体细胞优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。

第14页,共68页，2024年2月25日，星期天五、动物受体细胞优点：能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的mRNA。真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的16～20倍。易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。缺点：组织培养技术要求高，难度较大。目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。第15页,共68页，2024年2月25日，星期天一、重组基因导入原核受体细胞(一)转化转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。转化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球菌中发现的。

第二节重组DNA分子转入受体细胞第16页,共68页，2024年2月25日，星期天第17页,共68页，2024年2月25日，星期天细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。第18页,共68页，2024年2月25日，星期天转化的办法：用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法用复合剂制备感受态细胞高压电穿孔转化法三亲本杂交接合转化大肠杆菌第19页,共68页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞的是根据人们需要构建的外源重组质粒DNA分子，而非来自供体菌的游离DNA片段(转化因子)。因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法之一是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法。第20页,共68页，2024年2月25日，星期天Ca2+诱导的大肠杆菌转化法Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：①在0°C的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。

第21页,共68页，2024年2月25日，星期天用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法

细菌在低温下经CaCl2溶液处理，细菌细胞膨胀成球形，提高了膜的通透性，转化混合物中的DNA，形成抗DNase的羧基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面上，经42℃短时间热冲击处理，会使受体细菌中诱导产生出一种短暂的感受态。在此期间它们能够摄取各种不同来源的DNA，如λ噬菌体DNA或质粒DNA等。

完全适用于大多数大肠杆菌菌株，具有简单快速、重复性好的优点。每微克质粒DNA产生将近107个转化菌落，该效率可满足常规克隆的需要。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃备用。第22页,共68页，2024年2月25日，星期天第23页,共68页，2024年2月25日，星期天该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要。

第24页,共68页，2024年2月25日，星期天用复合剂制备感受态细胞

菌株暴露于组合的二价阳离子（MnCl2和CaCl2）中更长时间，并且用氯化六氨合高钴、DMSO、DTT（二硫苏糖醇）等复合试剂处理细菌以提高转化效率。高于5×108个转化菌落。第25页,共68页，2024年2月25日，星期天Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用MgCl2与CaCl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖醇(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高100～1000倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。

第26页,共68页，2024年2月25日，星期天DNA分子进入大肠杆菌受体细胞的机制

一般认为只有双链闭环或开环的质粒DNA分子才能转化，而线形DNA分子不能获得转化子。因此，环状DNA分子中混杂线形DNA分子，会影响环状DNA分子的转化效率。也有人认为吸附在受体细胞表面上的是双链DNA，但却以单链DNA进入细胞，这与革兰氏阳性菌的转化过程相似。第27页,共68页，2024年2月25日，星期天转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此须设以下几种对照处理：DNA对照处理。转化处理液中用0.2ml无菌水代替0.2m1感受态细胞，检验DNA溶液是否染菌。感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE缓冲液(500mMNaCl,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)代替0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染菌。感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml感受态细胞中加入0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNA。

第28页,共68页，2024年2月25日，星期天电穿孔转化法基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation)．形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每μgDNA可以得到109－1010转化子。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50％~70％细菌死亡时，转化水平达到最高。

第29页,共68页，2024年2月25日，星期天用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备容易得多．当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10％甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×l010个／m1。分装，在干冰上速冻后置于－70℃贮存。这样，每小份细胞融化后即可用于转化，有效期达6个月以上。电穿孔转化须在低温下(0－4℃)进行，转化效率要比在室温下操作提高约100倍。

第30页,共68页，2024年2月25日，星期天三亲本杂交接合转化大肠杆菌简称为三亲本杂交转移法，是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式．适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所需的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。但如果在宿主细胞中存在另外一种融合性的接合型质粒（即辅助质粒），非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。

第31页,共68页，2024年2月25日，星期天接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难以作为基因工程载体使用。目前常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，故重组质粒DNA分子也不能直接进行接合转化．而只能通过其迁移作用来完成。第32页,共68页，2024年2月25日，星期天首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，因此称为三亲本杂交接合转化法。第33页,共68页，2024年2月25日，星期天第34页,共68页，2024年2月25日，星期天转化率的计算及其影响因素

转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示；二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。

第35页,共68页，2024年2月25日，星期天以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率，首先必须通过菌液OD值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。然后计算转化子与受体菌的比率。第36页,共68页，2024年2月25日，星期天影响转化率的因素分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高，分子质量较大的重组质粒DNA分子转化率较低，对于大于30kb的重组质粒则很难进行转化。组成重组DNA分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构或线性结构的质粒载体有更高的转化率。经体外酶切、酶连操作后的载体DNA或重组DNA分子由于空间构象难以恢复，转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低两个数量级。重组DNA分子的浓度和纯度。在10ng／100μ1以下的DNA浓度范围内，转化效率与DNA分子数成正比关系。

第37页,共68页，2024年2月25日，星期天同一重组质粒DNA分子转化不同的受体菌细胞，转化率不同——受体细胞的选择对于重组DNA分子的转化也是极为重要。前述三种转化方法中，最佳转化率以电穿孔法最高（108~1010/μg）；Ca2+诱导转化法居中（107~108/

μg

）；而三亲本杂交转移法最低（104~105/μg

），但它适于前两种方法难以转化的受体菌。

第38页,共68页，2024年2月25日，星期天在转化操作方而，受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。如Ca2+诱导大肠杆菌转化法，菌龄、CaCl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热激时间均是重要的影响因素。电穿孔转化法中，对受体细胞进行冰冻甘油预处理后的转化率，要比不经此预处理的转化率高10~100倍。

第39页,共68页，2024年2月25日，星期天(二)重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌

将重组λ噬菌体DNA分子导入大肠杆菌受体细胞的常规方法是转导操作。转导(transduction)是指通过λ噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。

第40页,共68页，2024年2月25日，星期天具有感染能力的λ噬菌体颗粒除含有λ噬菌体DNA分子外，还包括外被蛋白。以噬菌体颗粒感染受体细胞，首先必须对重组A噬菌体DNA分子进行体外包装。体外包装，是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包装为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。

第41页,共68页，2024年2月25日，星期天基本原理，根据λ噬菌体DNA体内包装的途径，分别获得缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的λ噬菌体突变株。这两种突变株均不能单独地包装λ噬菌体DNA，但将它们分别感染大肠杆菌，从中提取缺失D蛋白的包装物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包装物(含D蛋白)，两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。

第42页,共68页，2024年2月25日，星期天λ噬菌体DNA体外包装的主要过程①制备包装物。首先，须培养两种溶原菌第二，诱导溶菌生长第三，收集和贮存包装物。②体外包装。制备λ噬菌体DNA混合液。第一次包装。包装物刚融化时，细胞发生破裂，释放出包装物可立即用于包装。第二次包装。进行第二次包装，可提高包装效率2－5倍，加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度，便于包装反应的进行。去除细胞屑。第二次包装后，在反应液中加入SM溶液和氯仿，混匀后离心去除碎屑。上清液中含活的噬菌体颗粒。第43页,共68页，2024年2月25日，星期天经过体外包装的噬菌体颗粒可以感染适当的受体菌细胞，并将重组λ噬菌体DNA分子高效导入细胞中。在良好的体外包装反应条件下，每μg野生型的λ噬菌体DNA可形成108～109的pfu。对于重组的λ噬菌体DNA，包装后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可达到106～107pfu，完全可以满足构建真核基因组基因文库的要求。第44页,共68页，2024年2月25日，星期天(三)转染将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程，称为转染，类似于质粒的转化。完整的、未处理过的λ噬菌体DNA分子的转染效率仅为105~106，而处理过的重组λ噬菌体DNA分子的转染效率下降到只有103~104。噬菌体的转染在基因克隆实验中并不常用。第45页,共68页，2024年2月25日，星期天二、受体细胞的选择

野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性。因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株。通常应从以下几个方面加以考虑：第46页,共68页，2024年2月25日，星期天①限制与修饰系统这是导致外源重组DNA转化或转导效率低下的主要原因之一。应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞，以提高外源DNA分子的转化或转导效率。进一步使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既不能修饰，也不能限制外源DNA分子，更便于重组DNA分子的多种基因操作。

第47页,共68页，2024年2月25日，星期天②重组系统

进入野生型细胞的外源DNA分子能自发地与染色体DNA发生的体内同源重组反应由rec基因家族的编码产物所控制。RecA蛋白能促进DNA分子之间的同源联会和DNA单链交换，recA基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频率降低至10-6。recB、recC和recD基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率。因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，基因型为recA-、recB-或recC-等，有些大肠杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。

第48页,共68页，2024年2月25日，星期天③易于转化或转导可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态细胞的菌株作为受体菌细胞．第49页,共68页，2024年2月25日，星期天④有明显的选择性差异遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有Amp抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏感。当重组DNA分子转入受体细胞后，载体上的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特征，据此可以区分转化子与非转化子。如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征，可以直接筛选到外源基因表达的转化细胞。

第50页,共68页，2024年2月25日，星期天⑤感染寄生缺陷型从安全的角度上考虑，受体细胞不能具有感染寄生性。第51页,共68页，2024年2月25日，星期天第三节重组子的筛选将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子），现在这两者有通用的趋向。含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子

。第52页,共68页，2024年2月25日，星期天在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子。经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。

第53页,共68页，2024年2月25日，星期天一、遗传表型直接筛选(一)根据载体选择标记初步筛选转化子在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，作为筛选转化子的依据。第54页,共68页，2024年2月25日，星期天

一般的做法是将转化处理后的受体细胞接种在合适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。常用的选择标记基因主要是抗性基因以及表达产物可以发光或使反应底物显色的基因，相应的选择条件是可以被抗性基因产物分解的抗生素和除草剂，可以使基因产物发光的光线，或者是可以使基因产物显色的试剂。选择培养基是根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物．即为选择培养基。选择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。第55页,共68页，2024年2月25日，星期天（1）抗药性筛选第56页,共68页，2024年2月25日，星期天

当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。

第57页,共68页，2024年2月25日，星期天根据载体抗药性标志插入失活选择

含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。（2）插入失活筛选法第58页,共68页，2024年2月25日，星期天第59页,共68页，2024年2月25日，星期天第60页,共68页，2024年2月2