分光光度技术

分光光度技术一．概念分光光度法〔Spectrophotograph谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。长的光的吸取力量不同，因此，每种物质都具有其特异的吸取光谱。200－1000nm紫外光区：200－400nm可见光区：400－760nm760－1000nm二．根本原理谱及其强度，对不同物质进展定性和定量分析。吸取程度与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。定律：当单色光通过一吸取光的介质时，其光强度随吸取光介质的厚度增加而成指数削减，即I/I=e－K1L00I：入射光强度， I：出射光强度，L：介质的厚度自然对数的底，即2.718 K1:溶液的吸光率0ln〔I0/I〕=K1l换算成常用对数式，即log〔I0/I〕=0.4343·K1lK=0.4343·K1Kl也就是说：在溶液浓度不变时，溶液对光的吸取随溶液厚度的增大而增大。比尔〔Beer〕定律：单色光通过一光吸取介质时，光强度随介质浓度增长而成指数削减，即C：溶液浓度log〔I0/I〕=KC

I/I=e－K2L0也就是说：溶液厚度不变时，溶液对光的吸取随溶液浓度的增大而增大。Lambert－Beer定律log〔I0/I〕=KClA=KClA为吸光度，T为透光度K〔L·mol－1·cm－1〕标准管法〔标准比较法〕用一浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，在依据公式计算。A1=K1C1L1 A2=K2C2L2A1:浓度标准管 A2:未知浓度测定管A1/A2＝〔K1C1L1〕/〔K2C2L2〕A1/A2＝〔K1C1〕/〔K2C2〕K值一样，即：K1＝K2所以上式可改写为A1/A2＝C1/C2试验中，由于比色皿本身和溶剂也会产生肯定的光吸取，所以设置一个空白管，消退非待测物的吸取，所测值即为待测物的光吸取。标准曲线法读取各管吸光度三．仪器的构造定义：对某一波长的光吸取值〔吸光度〕进展测定的仪器称为分光光度计。〔全波段〕分光光度计。构造组成①光源：要求能供给所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。360－1000nm，用于可见光区，近紫外光区和近红外光区氢灯或氘灯：工作范围150－400nm，可作紫外光分光光度计的光源②分光系统〔单色器为色散元件，将不同波长的光分开③吸取池〔比色皿、比色池330nm④检测器：光电池、光电管、光电倍增管组成仪器长附有自动记录器，可自动描出记录曲线。蛋白质化学试验一．双缩脲测定蛋白含量1.原理：蛋白分子中含有很多肽键，与双缩脲构造类似，在碱性溶液中与Cu2＋520nm波长下有2.方法：承受标准曲线法①标准曲线制作6双缩脲法操作步骤表试剂〔mL〕管号123456标准蛋白质溶液0.10.30.50.70.9－生理盐水0.90.70.50.30.11.0双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.0520nm6坐标，绘成曲线。0.9mL，4mL，37℃520nm100mL二．考马斯亮兰法测定蛋白质含量过范德华力结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色变成蓝色，最大吸取峰从595nm1优点：灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg；测定速度快、简便，只需一种试剂；干扰物质少。方法：承受标准管法3考马斯亮兰法测定蛋白质表试剂〔mL〕空白管标准管标本管生理盐水样品0.10.10.1考马斯亮兰试剂5.05.05.0度值。③计算标本/OD标准〕×50＝样品中蛋白质的含量μg/mL三．紫外分光光度法测定蛋白质含量280nm差。一般核酸在280nm260nm，因此溶液中同时存在核酸时，必需同时测定OD

OD

，通过计算消退核酸对蛋白质的影响算出蛋白质的含量。

260

280280nm280nm吸光度值是最常用的紫外吸取法。方法：承受标准曲线法1mg/mL。紫外吸取法标准曲线制作步骤表试剂〔mL〕管号123456标准蛋白质溶液0.51.01.52.02.50生理盐水3.53.02.52.01.54.0混匀，盛