医学免疫学实习指导

届学兔盛名

实习指导

主编:刘如意

主审:袁育康范桂香

参编：谢明王军阳周晓勃雷艳君任会勋史霖

西安交通大学医学院免疫教研室

二00四年一月

目录

免疫学实验的目的和要求.........................................................2

实验室规则......................................................................2

第一篇非特异性免疫检测........................................................3

实验一血脑屏障作用........................................................3

实验二吞噬细胞的功能试验...................................................4

实验三溶菌酶的溶菌作用....................................................7

实验四血清总补体活性测定（CH50单位测定）................................9

第二篇特异性体液免疫检测.....................................................11

实验五凝集反应........................................................11

实验六沉淀反应............................................................17

实验七补体结合反应.......................................................25

实验八中和实验（Neutrlizationtest）......................................29

实验九免疫标记技术.......................................................33

实验十免疫血清的制备及效价测定...........................................40

实验十一体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验PFC）......................43

第三篇细胞免疫检测............................................................46

实验十二E-玫瑰花环形成实验................................................46

实验十三淋巴细胞转化实验..................................................48

第四篇：免疫病理反应...........................................................52

实验十四豚鼠速发型过敏反应................................................52

实验十五免疫复合物型超敏反应..............................................53

实验十六豚鼠结核菌素试验..................................................55

实验十七小鼠DNFB试验...................................................56

1

免疫学实验的目的和要求

•每次实验前必须做好预习，明确本次实验的目的、内容、操作要点和相关的

理论知识。

­进入实验室必须严格遵守实验室规则。

•实验中听从老师指导，依照三严（严肃、严格、严密）要求进行实验，做好

实验记录。

•认真观察分析实验结果，写出实验报告。实验中遇到的有关问题，用科学的态

度总结探讨其原因,培养分析问题和解决问题的能力。

实验室规则

•进入实验室必须穿好白大衣。

•除实验中必须的学习用品外，不要放实验台上。

•实验室内不允许吃食品、饮水，严禁吸烟。

•实验中一定要保持实验室安静，不要大声喧哗，严禁打闹。

•实验要按老师要求操作，如发现问题要及时报告指导老师。

•爱护实验器材，如有损坏应及时报告老师，需赔偿者按规定办理。

•实验完毕要清理台面，需冲洗者按要求冲洗，需收回者按要求摆放整齐收回。

•离开实验室时，一定要有专人负责关好门窗、水源及照明设备。

2

第一篇非特异性免疫检测

实验一血脑屏障作用

［基本原理］

血脑屏障由软脑膜、脉络丛的毛细血管壁和包在壁外的神经胶质细胞形成

的胶质膜构成，起着天然的屏障作用，可以阻挡病原微生物及毒性产物、异物

颗粒包括染料颗粒等从血流进入脑组织和脑脊液内，从而保护中枢神经系统免

受损害。

［实验材料］

2只小鼠。1ml无菌注射器（配4号针头）。5%台盼蓝水溶液。

生理盐水0.Imlo眼科剪子和镜子等。

［实验方法］

•用1ml无菌注射器吸取5%台盼蓝水溶液经尾静脉注入两只小鼠体内，每只

0.7mL更换注射器，给其中一只小鼠颅内注射生理盐水0.1ml。

•5-10分钟后观察小鼠皮肤，尤其是眼、嘴的颜色变化。

­于30-60分钟，见小鼠眼、嘴呈现蓝色，即窒息死亡，腹部向下固定。

•由头到尾沿背中线剪开皮肤，暴露皮下、肌肉和内脏，观察颜色变化。

•小心剖开颅骨和椎骨，暴露脑和脊髓，与皮下、肌肉及内脏比较；并比较2

只小鼠有何不同。

［实验结果］

未经颅内注射的小鼠，眼、耳、鼻皮下及肌肉均呈现明显的蓝色，但脑、脊髓

均未变色；而经颅内注射的小鼠上述部位可呈现明显的蓝色。

［注意事项］

•台盼蓝水溶液要经过滤后方可使用。

•尾静脉注射要从远断进针；如推注容易，表明进入了血管；如引起皮下凸起

或发白，说明未进入了血管；拔出针头，从稍近断进针。

（谢明）

3

实验二吞噬细胞的功能试验

巨噬细胞能吞噬鸡红细胞、中性粒细胞可吞噬多种细菌，如葡萄球菌等。将巨

噬细胞和中性粒细胞分别与鸡红细胞、表皮葡萄球菌混合，孵育一定时间后涂

片染色镜检；见巨噬细胞可吞噬鸡红细胞；中性粒细胞可吞噬葡萄球菌，可计

算出吞噬异物的细胞数和吞噬细胞中吞入的异物数。在巨噬细胞中亦可见到鸡

红细胞发生形态改变。具此可判断两类吞噬细胞的吞噬功能和消化功能，用以

评价机体的免疫状态。

［实验目的］

证实吞噬细胞的吞噬作用。了解机体的非特异免疫防护作用。

一、豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用测定（大吞噬）：

［基本原理］

淀粉可以刺激豚鼠腹腔引起非感染性炎症渗出，在腹腔局部出现较多巨噬细胞,

巨噬细胞则能吞噬注入腹腔的鸡红细胞等较大异物。

［实验材料］

•实验动物：豚鼠

•鸡红细胞悬液：从鸡翼下静脉或心脏取血，按1:5比例保存于Alsever氏

保养液中，放4C°冰箱可用1个月，用前将鸡红细胞用生理盐水洗3次，第3次

洗涤2000r/min,5min,弃上清，压积细胞用生理盐水配制为5%鸡红细胞悬液，

供大吞噬试验用。

•5%淀粉肉汤溶液、姬姆萨染液、玻片、注射器等。

［实验方法］

•取无菌5%淀粉肉汤溶液51nl注入豚鼠腹腔，常规饲养三天；实验前1小时再次

注入豚鼠腹腔无菌5%淀粉肉汤溶液5mL然后注射5%鸡红细胞悬液5ml,轻揉其

腹部，使鸡血球均匀分布。

•在注射后30分钟、1小时、2小时、3小时、分别用注射器抽取豚鼠腹腔液推

片。

•自然干燥后，姬姆萨染色，油镜观察。

［实验结果］

4

计算100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数目及被吞噬的鸡红细胞的总

数，并观察鸡红细胞的消化程度，按下列公式计算吞噬百分比和吞噬指数。

吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数i

吞噬百分比---------；--------------XJLUU为

10吐巨噬细胞

100个巨噬细胞中被吞噬鸡红细胞数

吞噬指数=X100%

100个巨噬细胞

鸡红细胞被消化的程度分4级：

I级：未消化，胞质浅红或浅黄，胞核浅紫红色。

n级：轻度消化，胞质浅黄绿色，核固缩，成紫蓝色。

m级：重度消化，胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。

w级：完全消化，巨噬细胞内只见形状类似鸡红细胞大小

的空泡，边缘正齐，胞核隐约可见。

二中性粒细胞吞噬作用的测定（小吞噬）：

［基本原理］

血液中的中性粒细胞有吞噬病原微生物等较小异物的能力。将新鲜血液和细菌

混合，经合适的时间后涂片染色，即能观察到被吞噬到中性粒细胞内的但还没

有被消化掉的细菌。

［实验材料］

•白色葡萄球菌：肉汤培养液中37C0培养16-18小时待用。

,新鲜抗凝人血0.5mlo

•瑞氏染液、显微镜、孵箱、玻片等。

［实验方法］

1.吸取0.1ml白色葡萄球菌液加入新鲜抗凝人血0.5ml中，摇匀，37C°孵育

30分钟。

2.孵育过程的前20分钟，每隔5分钟轻轻振荡一次，共4次，后10分钟静置孵

育。

5

•孵育结束后，用毛细滴管从红细胞层表面吸取上清少许推片。

•自然干燥后，滴加瑞氏染液染色1分钟，再加等量蒸储水混匀，静置4分钟水

洗，晾干油镜观察。

［实验结果］

计算100个中性粒细胞，分别计算吞噬有细菌的中性粒细胞数目和被吞噬的细

菌总数，计算吞噬百分比和吞噬指数，正常人吞噬百分比为60%,吞噬指数大于

1=（计算方法同前）

［注意事项］

・血涂片应薄厚均匀适中，避免过薄或过厚。

•瑞氏染液染色时间不能过长以免染色过重。

（谢明）

6

实验三溶菌酶的溶菌作用

［实验目的］

证实体液中溶菌酶的存在及溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用。

［基本原理］

溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要

成分。溶菌酶能切断粘肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的B-

1,4糖昔键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由于细菌细胞壁的重要功能之一是

保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生

溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层

外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构，故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接做用。

［实验材料］

•溶壁微球菌(M.Lysodeikticus)：本菌是由空气中分离出的一种革兰氏阳性

菌，对人不致病，菌落黄色，普通琼脂培养基生长良好，每月传代一次或冻干

保存，用于制备溶壁微球菌琼脂平板。

•标准溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用l/15mol.L-1PBS配制为1000ug/ml

原液，并稀释为100、50、10ug/ml标准液，用前保存在冰箱中；用于阳性对照

及制备标准曲线。

•唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。

•其它：无菌打孔器(孔径2mm),无菌毛细吸管、米尺等。

［实验方法］

•用无菌打孔器在溶壁微球菌琼脂平板上打孔，用针头挑出孔内琼脂，孔径2mm

左右，孔距5-20mm。

•用毛细吸管取新鲜收集的睡液加入琼脂孔内，每孔加一滴，每滴约有0.025ml,

同时加标准溶菌酶作阳性对照。

•置24-28C°下12-18h观察结果。

［实验结果］

用小米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可与标准溶菌酶阳性

对照作对比观察。

7

如需定量测定检品（唾液）中的溶菌酶含量，可将上述各种稀释度的溶菌酶标

准溶液，分别加入小孔中，同法测定溶菌环直径，用半对数纸制成标准曲线，

检品中的溶菌酶含量可从标准曲线上查出。

［附录］

•溶壁微球菌琼脂平板的制作：①溶壁微球菌在使用前于琼脂斜面上传代一次,

然后接种于普通琼脂平板，37C°培养24小时，用l/15mol.LTPBS或无菌蒸储

水洗下菌苔，洗涤两次，2000r/min,离心30min,弃上清，称量沉淀物湿重，用

无菌蒸储水配成100mg/ml的菌液。②称取优质琼脂粉1g加入l/15mol.L-1PBS

100ml,制成1%琼脂。③取上述菌液1ml,加入加热融化并放至50-60C°的琼脂

中，摇匀倾注平板。冷凝后即为溶壁微球菌琼脂平板。

・l/15mol.L-1PBS的制备：0l/15mol.L-1KH2P04:KH2P049.07g加蒸储

水至1000ml；@l/15mol.L-1Na2HP04:l/15mol.L-1Na2HP041L87g力口蒸播

水至1000ml；③至15mol.L-1PBS（pH6.4）：取l/15mol.L-1KH2P0473ml加

l/15mol.L-1Na2HP0427mL加NaCLO.5g即为pH6.4的l/15mol.L-1PBS.

（谢明）

8

实验四血清总补体活性测定(CH50单位测定)

［实验原理］

补体能使抗体致民敏的羊红细胞发生溶血反应,根据溶血程度可测定补体总活

性。以溶血百分率作纵坐标,相应的血清补体量为横坐标绘图,可知在50%溶血附

近补体的量与溶血的程度呈直线关系。因此以50%溶血作为终点较以100%溶血作

为终点更为敏感。故称为50%溶血试验，即CH50(50%complementhemolysis)。

产生50%溶血所需补体的量为一个CH50单位。

［实验材料］

待测患者血清

5%绵羊红细胞悬液

3u/0.1ml溶血素

PH7.2巴比妥缓冲液或生理盐水

370c水浴箱、小试管、吸管等

［实验方法］

取小试管8支，依次编号；

1-6管加入巴比妥缓冲液0.2ml；

于第1管加入待测血清0.2ml,混匀后吸出0.2ml加入第2管……依次对倍稀释

至第6管，从第6管吸取0.2ml弃去，此时各管血清稀释度依次为1/2、1/4、

1/8...1/64；

1-6管加入巴比妥缓冲液0.2ml,第7管加0.4ml,第8管加0.5ml,

1-7加溶血素0.1ml；

每管各加绵羊红细胞0.1ml,轻轻摇匀，置370C水浴箱30分钟,40C冰箱过夜。

血清总补体活性测定操作表单位：ml

9

试管号12345678

巴比妥缓冲液0.20.21、0.2；\

待测血清0.2」0.2」0,2」0.2」0.2」0.2」—弃去Q2

巴比妥缓冲液0.20.20.20.20.20.20.40.5

溶血素0.10.10.10.10.10.10.1-

5%绵羊红细胞0.10.10.10.10.10.10.10.1

6为实验测定管；第7管为溶血素对照管；第8管为绵羊红细胞对照管

50%标准溶血管的配置：

取5%绵羊红细胞1ml,离心后弃上清,加入蒸储水0.5ml,使红细胞全部溶解,再加

双倍（1.7%）生理盐水0.5ml,混匀后加5%绵羊红细胞1ml。混匀取此液0.1ml加

巴比妥缓冲液0.5ml即为50%标准溶血管。

［实验结果］

以50%溶血管为标准，肉眼依次观察，与标准管最接近者为终点管。按下式计算

1ml血清的补体单位。

血清中补体活性单位（CH50单位）=1/血清总量X终点管稀释倍数

本法测得血清总补体活性的正常值为80-160CH50u/ml

［注意事项］

待测血清要求新鲜，一般要求在去血后2小时做完实验。

试管口径大小一致，清洁透明，便于观察。

50%标准溶血管配置必须用同批实验用绵羊红细胞，并同时方入冰箱。

思考题：

何谓一个CH50单位？何谓溶血素？

如何计算每ml血清所含的CH50单位数？

（刘如意）

10

第二篇特异性体液免疫检测

实验五凝集反应

凝集反应是指细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖抗原的颗粒状物质与相应

抗体特异结合，在适量电解质存在的条件下，形成肉眼可见的凝集现象。

一、直接凝集反应

颗粒性抗原(如细菌、红细胞等)直接与相应特异性抗体结合，在适量电解质

存在条件下，出现肉眼可见的凝集现象，称直接凝集反应。参加凝集反应的抗

原称为凝集原，而抗体则称为凝集素。直接凝集反应有玻片法和试管法两类。

(-)玻片凝集反应

在玻片上进行的直接凝集反应,主要用于抗原的定性分析,数分钟之内便可观察

结果,快速、简便。常用于细菌的分型鉴定,也用于ABO血型的测定。

【实验材料】

(1)抗原：受检菌液或受检者的血细胞盐水悬液。

(2)抗体：用于细菌鉴定的1：20稀释诊断血清。

血型检测的A及B诊断血清。

(3)生理盐水、玻片、吸管、接种环。

(实验方法】

(1)于洁净玻片的一端加诊断血清1滴，另一端加生理盐水1滴作阴性对照。

(2)用接种环取待检菌液或血细胞悬液分别涂于诊断血清和生理盐水，混匀。

(3)轻摇玻片，静置数分钟，观察结果。

【结果分析】

玻片上抗原凝集成肉眼可见的小团块状或絮状凝集物，其周围液体澄清，为阳

性反应。阴性反应和生理盐水对照均不发生凝集，为均匀混浊的乳状液。

［注意事项】

11

细菌鉴定时，特别是肠道菌种的沙门菌属或志贺菌属，原则上先用多价诊断血

清检测，如为阳性，再用单价诊断血清进行分群或定型。血型测定时，室温需

保持在200c左右，若低于10oC,易出现冷凝集现象而造成假阳性的错误诊断。

(-)试管凝集反应

是用定量的颗粒性抗原悬液与一系列倍比稀释的待检血清在试管中进行的凝集

反应，根据试验结果判定待检血清中有无相应抗体及其效价，对血清中抗体进

行半定量分析。此法目前仍常用于某些病原微生物感染的免疫学诊断，例如，

诊断伤寒和副伤寒的肥达氏(Widaltest)反应，诊断斑疹伤寒的外一裴氏反

应(weil-felixtest)。

［实验材料】

诊断菌液，1:10稀释的待检血清，生理盐水，小试管，刻度吸管，试管架，恒

温水浴箱。

［实验方法】

(1)稀释待检血清取8支试管排列于试管架上,依次编号,每管加入0.5ml生理盐

水。于第1管中加入0.5ml待检血清，充分混匀后，吸出0.5ml加入第2管，同法混

匀后又吸出0.5ml加入第3管,依次类推,连续稀释至第7管,最后从第7管中吸出

0.5ml弃去。第8管为生理盐水对照管。

(2)于各管中加入诊断菌液0.5ml,振摇试管架，充分混匀。

试管凝集反应操作程序

试剂12345678

生理盐水0.510.510.5[0.5-10.5-10.50.510.5

待检血清0.5J<0.5卜，0.5八0.540.540.5厂0.5户、弃去0.5

血清稀释倍数1:201:401:801:1601:3201:6401:1280—

诊断菌液0.50.50.50.50.50.50.50.5

(3)将试管静置于370c恒温水浴箱中40min。

【结果分析】

(1)首先观察阴性对照管，应无凝集现象，管底沉积呈圆形，边缘整齐，轻

轻摇动则沉积菌分散均匀呈混浊现象。

•观察实验管，凝集现象可根据强弱程度，分为五级：

12

++++细菌全部凝集，管底形成大片凝集物。

+++细菌大部分凝集，管底的片状凝集物较小而薄。

++约半数的细菌发生凝集，管底出现凝集环。

+仅有少部分细菌凝集，管底可见沉积的细菌周边有稀疏、点状的凝集物。

一液体混浊，无凝集。

（3）血清抗体效价的判定：以出现明显凝集现象（++）的血清最高稀释度作

为受检血清的抗体效价。

【注意事项】

实验中应注意反应体系的温度、电解质浓度及酸碱度（pH值）。

二、间接凝集反应

将可溶性抗原（或抗体）先吸附在一种与免疫无关，一定大小的载体颗粒表面

成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）结合，在适量电解质存在的条

件下，出现肉眼可见的特异性凝集现象，称间接凝集反应，此法敏感度比直接

凝集反应高，因而广泛地应用于临床检测中，间接凝集反应中常用的载体颗粒

有人“0”型红细胞、动物红细胞、活性炭或硅酸铝颗粒，聚苯乙烯乳胶微球

（-）正向间接血凝试验

将绵羊红细胞或人的“0”型红细胞用醛类固定（称为醛化，可改变血球表面

性质，使其易于吸附蛋白质类抗原，并可长期保存使用），再将可溶性抗原吸附

于醛化的血细胞上，制成抗原致敏的红细胞，当与相应的抗体结合，使红细胞

被动的聚合在一起，出现肉眼可见的凝集现象，常用于检测传染病抗体或自身

抗体。

【实验材料】

（1）抗原制备：将伤寒杆菌接种在培养基上，37oC培养24小时，用生理盐水

洗下，100oC水浴2小时，离心弃上清，稀释后备用。

（2）致敏红细胞的制备：取稀释的抗原与等体积的己醛化的2%SRBC混合，37oC

水浴2小时，每隔15分钟振摇一次，取出后洗涤弃上清，稀释成0.5%备用。

（3）试管、试管架、刻度吸管、恒温水浴箱。

（实验方法】

13

(1)取8支小试管排列于试管架上，依次编号。每管加入0.25ml生理盐水。于

第1管内加入1:10稀释的免疫血清0.25ml混匀，倍比稀释至第7管。第8管为阴性

对照。

(2)每管中加入0.25ml致敏绵羊红细胞，振摇试管架，使之充分混匀。

(3)将试管架静置于370c恒温水浴箱中1小时。

正向间接血凝试验操作程序

试剂12345678

生理盐水0.2510.25[0.25]0.2及0.25[0.25^0.25]0.25

八0.25「、0.25八0.25厂0.25八0.25J、弃去0.5

1:10免疫血清0.25」“0.25

血清稀释倍数1:201:401:801:1601:3201:6401:1280—

致敏SRBC0.250.250.250.250.250.250.250.25

［结果分析］

(1)首先观察阴性对照管，应无凝集现象，管底红细胞沉积呈圆形，边缘整

齐，轻轻摇动则沉积菌分散均匀呈混浊现象。

(2)观察实验管，凝集现象可根据强弱程度，分为五级：

++++细菌全部凝集，管底形成大片凝集物。

+++细菌大部分凝集，管底的片状凝集物较小而薄。

++约半数的细菌发生凝集，管底出现凝集环。

+仅有少部分细菌凝集，管底可见沉积的细菌周边有稀疏、点状的凝集物。

—液体混浊，无凝集。

(3)血清抗体效价的判定：以出现明显凝集现象(++)的血清最高稀释度作

为受检血清的抗体效价。

［注意事项】

•红细胞需来自同一个体、批号相同，且致敏血球应新鲜配置。

•使用器材必须清洁，否则对结果有很大影响。

14

(二)反向间接血凝试验

将特异性抗体吸附于醛化的红细胞上，再与相应抗原结合，在适量电解质存在

条件下，红细胞被动聚集出现肉眼可见凝集现象。用于检测标本中的相应可溶

性抗原。

【实验材料】

(1)1：20抗一血$致敏的醛化血球、纯化的1:20抗一HBs、待检血清、稀释液。

(2)“V”型微量血凝板，0.025ml稀释棒、微量搅拌器、刻度吸管、滴管(40

滴/ml)。

【实验方法】

(1)配制致敏血球悬液于每瓶冻干诊断血球加41nl稀释液，轻轻旋摇使成均

匀血球悬液，浓度约为0.6%。

(2)正式试验

①在“V”型微量血凝板上，每份待检血清设立8孔，于各孔内用40滴/ml滴管

各加1滴稀释液(相当于0.025ml)。

②用0.025ml容量的稀释棒蘸满待检查血清分别依次在各孔内捻转作倍比稀释

(一般每孔内均需捻转10次左右)，直至第7孔，第8孔为致敏血球对照。另设第

9孔为阳性对照，加0.025mlHBsAg阳性血清。

③于每孔中加0.025ml混匀的致敏血球悬液。

④将血凝板置于微型振荡器上振荡「2分钟，置370cl小时后观察结果。

反向间接血凝试验操作程序

试剂123456789

生理盐水0.2510.2510.25-10.2510.25i0.2510.2510.25阳性血清

恃检血清0.25卜0.25J\.25-1•O.25,1，0.25）、0.25八0.25；、^去0.25

血清稀释倍数1:201:401:801:1601:3201:6401:1280—

致敬SRBC0.250.250.250.250.250.250.250.25

【结果分析】

不凝集：红细胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圆点。

15

明显凝集（++）:红细胞于孔底形成薄膜状凝集，中央可见疏松的红点。

出现明显凝集的血清最高稀释度为HBsAg效价，凡效价21:16者需进一步做中

和试验。

中和试验

在血凝板上每份标本设测定排与对照排，每排8孔。于每孔加稀释液0.025ml,

用2支稀释棒蘸取被检血清，分别在2排作倍比稀释到第7孔，第8孔不含血清，

为血球对照，然后，于测定排各孔加稀释液0.025ml,对照排各孔加1:20抗

HBsAgO.025ml,血凝板振荡1~2分钟，置370c30分钟。取出，于各孔加0.025ml

致敏血球，振摇混匀，置370cl小时后观察结果。

凡正式试验效价21:16,且中和试验的对照排凝集孔数至少低于测定排凝集孔

数2孔者，为HBsAg阳性，否则系非特异性凝集。

【注意事项】

（1）配制的致敏血球悬液一般当天用完，若置2~10oC,使用期不超过3天。

（2）试验用的血凝板、滴管、稀释棒等器材必须十分清洁，否则易造成非特

异性凝集。

•血凝板、稀释棒用后均需用次氯酸钠（10%v/v）浸泡过夜；滴管需煮沸10分

钟，然后用水冲净，再用蒸储水冲洗，晾干备用。

思考题：

•试述直接凝集反应和间接凝集反应的异同点。

•正向间接血凝试验与反向间接血凝试验在原理上有何相同和不同？正向间接

血凝试验可否应用微量血凝板测定法？

（雷艳君）

16

实验六沉淀反应

可溶性抗原（如血清中的蛋白，组织浸出液，细胞裂解液等）与其相应的抗体在

溶液中或凝胶中结合,若比例合适,可形成肉眼可见的抗原-抗体复合物,这就是

免疫沉淀反应。免疫沉淀反应可以在小玻璃管中或毛细玻璃管及凝胶平板中进

行。在用凝胶平板做实验时,常用琼脂糖凝胶做介质,有的加电流,使反应更快更

灵敏。

一、环状沉淀

【实验原理】

在环状沉淀试管中，当可溶性抗原与相应特异性抗体结合后，于两者交界面处

可形成白色沉淀环。此法系Ascoli于1902年建立，用于检查兽类内脏、皮毛浸

液等标本中炭疽杆菌抗原，由于其较高的灵敏性和特异性，目前仍用于法医学

血迹鉴定、流行病学媒介昆虫的吸血习性鉴定等。

［实验材料】

待测血迹干燥纸片

抗人血清抗体、抗羊血清抗体和抗鸡血清抗体

生理盐水

环状沉淀管及管架、吸管等。

【实验方法】

1、取环状沉淀管3支，分别加入抗人、抗羊和抗鸡血清抗体各0.1ml于管底部,

并注明，置于管架上。

2、另取3支试管，分别将3种血迹纸片加入，再各加生理盐水1ml,室温5-10分

钟后将溶液摇匀。

3、吸取上清液分别加入上述含有抗人、抗羊、抗鸡血清抗体的环状沉淀管内，

并使两者形成一清晰交界面。置室温下『5分钟观察结果。

［结果分析］

根据是否与已知抗血清出现白色沉淀环，判定血迹类型。

【注意事项】

17

1、因血清分子密度及比重均大于生理盐水，故当加入含有抗原的生理盐水时只

需将沉淀管倾斜，加抗原的吸管勿接触抗血清，使含抗原的生理盐水沿管壁缓

缓流下，再将沉淀管直立即可呈一清晰交界面。

2、在加抗原时，吸管的头部切勿触及抗血清，否则不仅使抗原抗体混合，不能

呈清晰交界面，而且如再用此吸管加抗原于另一支含不同抗血清的沉淀管后，

必然会出现交叉反应，无法判定结果。

二单向扩散

【实验原理】

抗原或抗体这两种成分中只有一种扩散，将已知抗体与琼脂混合，将抗原

置于凝胶孔中，抗原则呈辐射状扩散，在孔的周围与抗体结合，在比例合适的

地方形成肉眼可见的沉淀环。当抗体的浓度一定时，抗原的浓度与形成沉淀环

的直径成正比。

［实验材料】

1%琼脂糖（琼脂糖lg,O.Imol/LpH8.6巴比妥-巴比妥钠缓冲液100ml）,玻片

或培养皿，凝胶打孔器（直径3mln）,水浴箱，10ml吸管，5口1微量加样器，

已知抗体，标准抗原，待测抗原。

【实验方法】

1）取一张玻璃片，用水冲洗干净，再用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水

平台备用。

2）将1%琼脂糖融化，56℃水浴中保温

3）取15ml琼脂糖加到56°C预热的玻璃管中，加入适量的抗体（约200ml）

充分混匀后平铺于玻璃片上。

4）待凝胶凝固后打孔（直径3mm）

5）将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔中，每孔5111

6）将凝胶板置于湿盒，室温过夜（24h以上）后观察结果八

7）绘制标准曲线，测出样品中相应抗原含量。

［结果分析］

1本实验主要用于检查血型中IgG,IgA，IgM以及补体成分C3,C4等

18

的含量/由于各类免疫球蛋白的分子量大小不等，因此同样浓度的IgG,

IgA,IgM在琼脂糖中的扩散速度各异，IgG扩散最快，形成的沉淀环直径

最大，IgM的分子量最大，扩散速度慢，形成的沉淀环较小。

2形成的沉淀环大小与抗原或抗体的浓度相关，因此临床检测时应先调整抗体

和抗原各自的最适浓度，抗体的最适浓度应使免疫扩散后的沉淀环边缘清晰，

且能测出血清中的免疫球蛋白的正常值和最大限度的异常值。抗体浓度过高，

形成的沉淀环直径小；浓度过低，不易检测抗原的最高限浓度。沉淀环的大小

与所检测的抗原浓度成正比。抗原浓度过低时，沉淀环太小不易测定，过高时,

沉淀环太大，浪费抗体。

沉淀环

单向扩散示意图

三双向扩散

【实验原理】

双向免疫扩散是指抗原和抗体在同一凝胶内部扩散，彼此相遇后形成特

异性的沉淀线。该反应是将抗原和抗体加入同一凝胶中两个相隔一定间距的小

孔内，使两者进行相互扩散。当抗原和抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成

一白色弧型沉淀线。

【实验材料】

1%琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径3mm）,水浴箱，10ml

19

吸管，5u1微量加样器，抗原，抗体。

【实验方法】

1）取一张玻璃片，用水冲洗干净，再用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平

台备用。

2）将1%琼脂糖融化，56℃水浴中保温。

3）将1%凝胶约3ml铺于玻片上，待凝固后打孔，直径3mm,间距10mm。

（如图所示）

4）中心孔加5u1抗体，周围孔内每孔加5u1抗原样品（抗原抗体均

需预先做系列稀释以获得适宜的抗原抗体比例）。

5）将凝胶板置于湿盒，室温过夜（24h以上）后观察结果。

［结果分析］

1）阳性结果为在抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线。若出现几条沉淀线表明抗

原与抗体均不是单一组分。

2）此法可用来比较两个抗原的相关性。当两种抗原的决定簇完全相同时，则

与抗体形成的沉淀线相吻合；若两抗原的决定簇完全不同时，则与抗体形成的

沉淀线呈不相关的交叉线；若两种抗原有部分决定簇相同时，则与抗体形成呈

部分交叉的沉淀线。

20

四火箭电泳

将抗原抗体反应置于一定的电场中进行，能使抗原抗体反应更加快速，灵敏。

根据方法的不同，主要有火箭电泳，对流免疫电泳，交叉免疫电泳等。

［实验原理】

火箭电泳是把单向扩散技术与电泳技术结合起来。抗原在含有抗体的琼

脂糖凝胶中电泳时，在电场的作用下，抗原向一个方向移动并逐步与凝胶中的

相应抗体结合形成沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比。

［实验材料】

1%琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径3mm）,水浴箱，10ml

吸管，5ix1微量加样器，已知抗体，标准抗原，待测抗原，电泳仪。

［实验方法】

1）取一张玻璃片，用水冲洗干净，再用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水

平台备用。

2）将1%琼脂糖融化，56℃水浴中保温

3）取15ml琼脂糖加到56℃预热的玻璃管中，加入适量的抗体（约200ml）

充分混匀后平铺于玻璃片上。

4）待凝胶凝固后打孔（直径3mm）

5）将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔中，每孔5lx1

6）在35v/cm电场中电泳30min。

7）根据标准稀释抗原的峰高绘制标准曲线，计算待检样品的抗原含量。

【结果分析】

1）本实验主要用于抗原的测定（只能测定Ug/ml以上的含量）。计算方法同

单向扩散，均需先根据系列稀释的标准抗原的峰高作出标准曲线，然后在标准

曲线上找出待检抗原对应的浓度。

2）可用于检测血清免疫球蛋白或分泌型IgA及补体C3等的含量。

21

3）一般来说，抗原应放在负极的一侧，因为多数蛋白性抗原在碱性电泳缓冲

液中带负电，在电场中向阳极运动。

五对流免疫电泳

【实验原理】

当抗原和抗体在琼脂介质中电泳时，抗体的PI比较高，在适当的pH值下，

抗体带正电荷而抗原带负电荷，故在电场中抗体向阴极方向移动而抗原向阳极

运动，直至相遇后形成沉淀线，其原理与双向免疫扩散相同，但具有方法简便,

快速及一次电泳可以检测多个样品等特点。

［实验材料】

1%琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径3mm），水浴箱，5ul微量加

样器，抗体，抗原，电泳仪，阳性对照血清，滤纸

［实验方法】

1）取一张玻璃片，用水冲洗干净后，再用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水

平台备用。

2）1%琼脂糖融化，56°C水浴中保温

3）吸取琼脂糖铺于玻璃板上，厚约1.5mm）,制成所需胶板。

4）等待琼脂糖凝固后，用打孔器成对打孔，孔径3mm,孔间距3mm。排距

3nuuo

5）在孔中分别加入抗原和抗体，每孔5R1

6）在电场中电泳30分钟（5v/cm）

7）观察结果。在两孔间出现沉淀线的为阳性。

［结果分析］

22

本实验是定性实验，用于多种疾病的检测，如HbsAg,AFP等的检测，血吸

虫，包虫病等抗体的测定。

五免疫电泳

［原理］在凝胶介质中将区带电泳法与免疫双扩散相结合的一种免疫化学方

法。先使血清在琼脂糖凝胶中电泳，在一定的电场强度下，由于血清中各种蛋

白质的分子大小及电荷状态和电荷量不同，泳动速率也各不相同，使各自组分

得到分离，然后在电泳轴的平行方向挖一长槽，加入抗血清，抗原与相应抗体

扩散，相遇，出现沉淀弧线。

［材料］设琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径3mm）,水浴箱，5u

1微量加样器，抗体，抗原，电泳仪，阳性对照血清，滤纸

［方法］

1）将玻璃板洗干净，用75%乙醇冲洗，晾干备用

2）将1%琼脂糖融化，56°C水浴中保温备用

3）铺板，打孔。

4）将凝胶孔加满抗原，其中一孔加电泳指示剂。

5）将凝胶板放在电泳槽中进行电泳10v/cm,根据指示剂判定电泳时间。

6）电泳后在凝胶板上沿电泳方向平行挖2mm左右宽的长槽，其中加入抗血清

或特异性抗体。

7）将凝胶板转入湿盒中，室温放置12或18小时，可观察到在一定位置出

现的沉淀弧线。

［结果与分析］

•临床上常用于M蛋白血症，确认该异常蛋白属于哪一亚类免疫球蛋白，或哪

一型轻链。

23

•鉴定蛋白质抗体，为单价抗体或多价抗体，如检测多克隆丙种球蛋白血症中

同时存在的高含量IgG,IgA和IgMo

•鉴定未知蛋白抗原（或抗体）。

免疫电泳示意图

思考题

1免疫沉淀实验中哪些可以用来检测抗原，哪些用来检测抗体？哪些是定性的,

哪些可以定量。

2免疫沉淀反应与凝集反应在应用方面有什么区别？

24

实验七补体结合反应

［原理］抗原与抗体结合形成的复合物能激活补体，若抗原是绵羊红细胞，那

么补体被激活后，使绵羊红细胞溶解，出现溶血现象。补体结合实验是一种有

补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。参与本反

应的五种成分可分为两个系统，一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待

检抗体（或抗原）另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。待检

抗原，抗体和先加入的补体作用后，再加入指示系统。若待检系统中的抗原-抗

体相对应，两者特异性结合后激活补体，再加入的指示系统无补体结合，不出

现溶血，是为补体结合实验阳性；若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一

方，补体不被激活，当指示系统加入后，绵羊红细胞-溶血素复合物激活补体,

产生溶血现象，是为补体结合实验阴性。

本实验敏感性，特异性均较高，可用于检测某些病毒病，立克次体病，梅毒病

等。由于参与反应的各成分之间要求有适当的量的关系，因此，做本实验之前

必须通过一系列预备实验来确定补体，溶血素，抗原或抗体的使用量。

［方法］

-）溶血素单位滴定

1材料：溶血素血清，抗原，2%绵羊红细胞悬液，补体（1:30取豚鼠新鲜血

清），生理盐水，小试管，吸管,37°C水浴箱。

2实验过程

1）按表分别加入各种不同稀释的溶血素0.2ml及其他成分。

2）充分混匀后置于37C水浴箱中30分钟，然后观察结果。

3）能呈现完全溶血的最高稀释度的溶血素为1个单位

4）配制2个单位的溶血素溶液。

例如下表的结果表明，第11管（1:9600倍稀释）中0.2ml溶血素为1个单位。实

验室常用0.2ml中含2个溶血单位的稀释液，即1:4800,配制时可以取1:100倍

稀释的溶血素1ml加生理盐水47ml。

例：溶血素的滴定表：

25

...........T落而莪612mi事…环布•T生理12%绵羊红

试管号g

结果

c稀释度I(1:30)盐水|细胞

I1I1：1000I0.20.40.2,完全溶血

21：1200I0.20.40.2完全溶血

-5-3K5

iitllllllllflllllllltllll

二

II3I1(11II6II<tot:!(-•1121(1411二(•2•

三

00二

三

三

二.

---完全溶血

皿

111:::X,111,,lllItllllltllllllllllllllill

114120o?-m2?=2

0=064.5-.

=-=

-T-m=

111w=ll>完全溶血

21111llol211112

44丽