间充质干细胞的临床应用心得

间充质干细胞的临床应用心得内容MSCs的生物学特性MSCs的免疫调控作用MSCs与免疫细胞（T、B、DC、NK、CTL）MSCs的免疫调控机制MSCs的临床应用第2页,共42页，2024年2月25日，星期天间充质干细胞生物学特性来源广泛自我更新、多向分化潜能易扩增传代能力MSCsIL-6,IL-7,IL-10,IL-11,SCF,SDF-1GM-CSF,M-CSF..adipocyteosteocytechondrocytemyoblastcardiocyteNervecellhepatocyte可来源于骨髓、胰腺、皮肤、肺脏等多处器官组织

体外能够传40代，并保持稳定的表型和多向分化的潜能（MesenchymalStemCells，MSCs)第3页,共42页，2024年2月25日，星期天免疫调节作用产生多种细胞因子分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、干细胞生长因子（SCF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、转化生长因子-β（TGF-β）等

表达多种细胞表面分子CD105、CD73、CD44、CD71、CD90、CD166、基质细胞抗原（STRO-1）等无MHC限制不管MSCs或T细胞来源种类，MSCs均能对T细胞增殖产生免疫抑制作用第4页,共42页，2024年2月25日，星期天狼疮骨髓MSCs（BMSCs）SLE骨髓（P0）MSCs第25d倒置显微镜观察×100人正常人与SLE患者BMSCs形态大小上无差异，均以长梭形为主孙凌云等，中华风湿病学杂志，2005形态观察第5页,共42页，2024年2月25日，星期天SLE组正常对照组原代培养时间26±7.76d17±5.46dP=0.029形态学无区别SLE与正常对照组BMSCs培养比较张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006扩增效率P5代后降低P10代后降低

第6页,共42页，2024年2月25日，星期天表达CD29、CD44和CD105

不表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR

正常组与狼疮组表型表达并无差异（P<0.05)张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006表面标记测定第7页,共42页，2024年2月25日，星期天dCellpopulation生长曲线呈S形SLE患者BMSCs总体生长较正常人缓慢

张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006正常人与SLE患者BMSCs生长曲线比较第8页,共42页，2024年2月25日，星期天对照SLEBeta-actinIL-7SLE中IL-6、IL-7表达降低（P<0.05）而IL-11,M-CSF表达无区别张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006正常人与SLE患者BMSCs细胞因子表达比较第9页,共42页，2024年2月25日，星期天张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006SLE患者BMSCs染色体组型

——为正常的染色体组型第10页,共42页，2024年2月25日，星期天鼠

BALB/cNZBWF1/J

（P0）×100

形态上无显著差异但狼疮MSCs增殖速度更快、传代时间更短不同于人？SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006形态学第11页,共42页，2024年2月25日，星期天MSCs与免疫细胞MSCs与T细胞不活化异基因T细胞抑制T细胞增殖包括初始和记忆性T细胞的增殖包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激对T细胞凋亡影响一：不诱导静止期T细胞凋亡（TseWTetal.Transplantation，2003，75：389-397.）二：诱导活化的T细胞凋亡（PlumasJetal.Leukemia2005;19:1597-604.）第12页,共42页，2024年2月25日，星期天与正常（BALB/c）及狼疮鼠（NZBWF1/J）BMSCs共培养均导致活化的T细胞凋亡下降（P<0.05)三：使活化的T细胞凋亡降低SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006

单独T细胞T＋狼疮BMSCsT＋正常BMSCs第13页,共42页，2024年2月25日，星期天1.正常鼠BMSCs对狼疮T细胞IFN-γ、IL-4生成的影响IFN-γ生成T细胞被刺激增多IL-4生成T细胞被抑制减少正常BMSCs可促进TH1而抑制TH2细胞生成—影响SLE病情DengW,etal.DNAandCellBiology.2005;24:458-463对T细胞亚群的影响T细胞内细胞因子测定第14页,共42页，2024年2月25日，星期天

与正常鼠BMSCs(BALB/c)共孵育：↑IFN-γ*,IL-12*IL-4*,IL-10,IL-6，TNF-α*

向TH1偏移与狼疮鼠BMSCs(NZBWF1/J)共孵育：↑IL-6*,IL-4,IL-10

↓TNF-α*

向TH2偏移#*##*##*2.BMSCs与正常T细胞共孵育前后细胞内细胞因子的变化SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006*为有统计学意义第15页,共42页，2024年2月25日，星期天

T-betβ-actinA.T＋狼疮MSCs

B.单独TC.T＋正常MSCsGATA-3β-actin

ABCABC与正常鼠BMSCs共培养：T-bet↑，GATA-3↓TH1↑与狼疮鼠BMSCs共培养：T-bet↓，GATA-3↑TH2↑转录因子T-bet和GATA-3

SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006第16页,共42页，2024年2月25日，星期天正常MSCs：使TH1/TH2平衡向TH1偏移狼疮鼠病情缓解？狼疮MSCs：使TH1/TH2平衡向TH2偏移狼疮鼠病情恶化？

狼疮鼠BMSCs对T细胞免疫调节功能存在缺陷对TH1/TH2平衡影响第17页,共42页，2024年2月25日，星期天MSCs与B细胞人BMSCs可抑制B细胞增殖增殖抑制与B细胞的凋亡无关，而与细胞周期滞留于G0/G1有关由可溶性细胞因子介导（不需细胞间直接接触）抑制抗体生成(IgA、IgM、

IgG)CorcioneA,etal.Blood.2006;107:367-372第18页,共42页，2024年2月25日，星期天MSCs与NK细胞静止期NK不能裂解人MSCs。IL-2活化的自体及异体NK细胞均可裂解BMSCsBMSCs抑制IL-2诱导的静止期NK细胞的增殖，部分抑制已活化NK细胞的增殖经IFN－γ预处理可抑制该裂解作用—上调MSCs的HLA-Ⅰ类分子水平阻止NK细胞的活化SpaggiariGM,etal.Blood.2006;107:1484-1490NK对MSCs的裂解作用.（E/T即NK/MSC）

第19页,共42页，2024年2月25日，星期天MSCs与DC细胞人BMSCs与DC共培养对DC分化、成熟、功能影响

显著抑制单核细胞向DC分化（无需细胞间接触）

抑制DC分泌TNF-α的能力引起免疫耐受成熟DC（CD83、HLA-DR、CD1a、CD80、CD86）表达↓，IL-12分泌↓向非成熟状态的偏离对同种T细胞的活化能力下降

JiangXXetal.Blood，2005;105:4120-4126

第20页,共42页，2024年2月25日，星期天MSCs与CTL抑制CTLs的细胞毒作用呈时间和剂量依赖不能抑制已活化CTLs的细胞毒作用通过可溶性因子介导

MSCs不是CTLs作用的靶细胞RasmussonI,etal.Transplantation，2003，76:1208-1213

第21页,共42页，2024年2月25日，星期天MSCs的免疫调控可能机制MSCs分泌可溶性细胞因子

CD8+调节性T细胞吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）

诱导调节性APCs

第22页,共42页，2024年2月25日，星期天机制分泌可溶性细胞因子介导

IL-10、TGF-β1、前列腺素E2（PGE2）、肝细胞生长因子(HGF)、IL-2、IL-2R等不需要细胞间直接接触矛盾观点不同细胞因子介导需要与T细胞直接接触不同的来源、提取、培养、鉴定方法等可能导致收集的MSCs亚群不同（见下表）第23页,共42页，2024年2月25日，星期天Extractionsites(Prinzetal.,1999)Bonemarrow(livedonors）:hip,sternum,brokenbonesBonemarrow(cadaverdonors):allsites(rare)Othertissue:teeth,fat,muscle,cartilage,synovialfluid,skinDevelopmentaltissue:foetal,umbilical,placentaDissociationmethodTrypsinationScrapingSuspensioncultureMarkercombinationsCD10+,CD13+,CD34+,CD56+,CD90+,MHC-1+(Youngetal.,1999)VCAM+,STRO-1+,CD73+,CD105+(Tulietal.,2003)Wnt2+,Wnt4+,Wnt5a+,Wnt11+,Wnt16+,Fz2+,Fz3+,Fz4+,Fz5+,Fz6+(Etheridgeetal.,2004)…IdentificationAdherencetoplasticMagneticbeadFACScellsortingOtherfactorsCelllineorexvivoDonorageDonorsexDonordiseasestatusMediumcompositionPointoffirstanalysisCultureconditions(temperature,motion,etc.)DifferentiationagentFrequencyofmediumchange…SetheS,etal.AgeingResearchReviews.2006;5:91-116第24页,共42页，2024年2月25日，星期天DjouadF,etal.Blood.2003;102:3837-3844诱导CD8+调节性Ｔ细胞产生MSCs作用的靶T细胞—CD8+亚群通过诱导CD8+调节性Ｔ细胞发挥免疫抑制作用Condedsplenocytes+MSCMLR鼠BMSCs抑制MLR中CD8+亚群的增殖CD8+亚群抑制淋巴细胞增殖第25页,共42页，2024年2月25日，星期天吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）介导BMSCs在IFN-γ的诱导下大量表达IDO

色氨酸犬尿素

抑制T细胞抗原应答色氨酸加入Ｔ细胞的增殖可显著恢复

IDO-介导的色氨酸降解—人BMSCs抑制T细胞增殖MeiselR,etal.Blood.2004;103:4619-4621第26页,共42页，2024年2月25日，星期天诱导调节性APCs产生人BMSCs可能干涉APCs的成熟转变为调节性APCs

BeythS,etal.Blood.2005;105:2214-2219缺乏T细胞活化能力接触依赖性伴前炎症分子IL-12,TNF-α，MHC-Ⅱ表达↓抗炎症细胞因子IL-10表达↑MSCs调节性APCs防止或减轻GVHD？第27页,共42页，2024年2月25日，星期天MSCs的临床应用优点无或低免疫原性

无MHC限制诱导宿主免疫耐受降低移植排斥反应第28页,共42页，2024年2月25日，星期天体外培养扩增MSCs作为组织工程的种子细胞，修复各种组织、器官作为基因治疗的载体细胞：转基因或基因修饰MSCs植入，替代有缺陷的骨髓利用免疫抑制、降低移植排斥，用于器官或组织移植与HSCs共移植治疗血液、肿瘤、免疫性等临床疾病防治GVHD

主要应用皮肤骨、软骨、肌腱关节脑神经组织心肌等第29页,共42页，2024年2月25日，星期天

DiseaseNo.SourceofMSCs/SCTOutcomeRef.StudyPatientsSettingHematologic15AutologousIVNoadverseeventsof1,Lazarusetal.malignanciesinfusion10,and50×106cellsBreastcancer28AutologousinIVinfusionwassafe;Koçetal.autologousSCTautologousSCTrecoverywasrapidInbornerrorsof11HLA-identicalNoimmuneresponseagainstkocetal.MetabolismfromSCTdonordonor;improvednerveconductiovelocityinmetachromaticleukodystrophyOsteogenesis5HLA-identicalfromGene-markedMSCsengrafted;Horwitzetal.ImperfectaSCTdonornewdenseboneformation;fewfracturesAcutemyeloid1HLA-haploidenticalSCTengraftmentwithnoGVHDLeeetal.LeukemiafromSCTdonorLeukemia31HLA-identicalfromRapidplateletengraftment;lowrassonietal.SCTdonorincidenceofacuteGVHDSevereaplastic1AllogeneicMSCEngraftment;improvedstromaFouillardetal.anemiaSevereacute1HaploidenticalMSC;ClearanceofgradeIVacuteLeBlancetal.GVHDunrelateddonorSCTGVHD,twice

MSCs与HSCs共移植的临床研究LeBlancC,etal.BiologyofBloodandMarrowTransplantation.2005;11:321-334第30页,共42页，2024年2月25日，星期天1.血液疾病女，20岁，急性白血病

—全身照射+传统化疗—5.7×106CD34+cells/kg+1.5×106MSCs/kg（来自患者父亲）—无急性GVHD或慢性GVHD发生—移植后31月血象正常，无病情复发LeeST,etal.BrJHaematol.2002;118:1128-1131.第31页,共42页，2024年2月25日，星期天2.肿瘤28名乳腺癌患者－接受高剂量化疗＋自体干细胞移植－静脉输注1～2×106/kg

MSCs－无输注后毒性反应发生－治疗后血小板>0.5×109/L的平均时间9d(4-19d)

中性粒细胞>0.5×109/L的平均时间8d(6-11d)KocON,etal.ClinOncol,2000;18:307-316MSCs可促进HSCs移植第32页,共42页，2024年2月25日，星期天3.GVHD（移植物抗宿主病）为HSCT常见并发症（20％－60％）预防方法

传统移植物中除去供者T细胞（体外T细胞清除）T细胞抗体处理(体内T细胞清除）免疫抑制药物使用新策略MSCs输注下调宿主抗原呈递细胞第33页,共42页，2024年2月25日，星期天31名患者接受HLA相匹配的同胞HSCs＋MSCs移植MSCs剂量1－5×106/kg无MSCs输注相关毒性反应急性II～IVGVHD发生率为15%(对照组40%,P=0.01)慢性GVHD发生率为12%（对照组67%,P=0.002)6月存活率88%（对照组67%)ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率FrassoniF,etal.BoneMarrowTransplant2002;29(suppl2)第34页,共42页，2024年2月25日，星期天MSCs治疗急性GVHD一例男，9岁，急性淋巴细胞白血病HSCT后发生Ⅳ型急性GVHD症状：腹泻，高胆红素血症，反复细菌、真菌、病毒感染常规抗GVHD治疗无效移植后73d予静脉输注2×106/kg

MSCs（来自患者母亲），第170d予1×106/kg

MSCs治疗效果：症状好转至消失，血胆红素正常，急淋缓解该中心1000例接受异基因HSCT患者中，25例发生急性Ⅳ型GVHD，除此例外，另24例均死亡（移植后0.5－5.5月，平均2月）如下图第35页,共42页，2024年2月25日，星期天患者移植临床过程LeBlancK，etal.Lancet.2004;363:1439–41结论:

利用MSCs的免疫抑制作用可治疗急性GVHD第36页,共42页，2024年2月25日，星期天MSCs治疗激素难控制型急性GVHD8例治疗组例数/次数急性GVHD8慢性GVHD1MSCs治疗1次6MSCs治疗2次3移植后急性GVHD消失6移植后死亡3巨细胞病毒胃肠炎1存活（2月－3年）5生存