肺炎链球菌的分离和鉴定

肺炎链球菌的分离和鉴定概述

肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。第2页,共46页，2024年2月25日，星期天

肺炎链球菌不产生外毒素，主要靠荚膜侵袭力致病。肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎，肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、支气管炎、心内膜炎、腹膜炎、关节炎、脑膜炎和败血症等。

第3页,共46页，2024年2月25日，星期天

细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。第4页,共46页，2024年2月25日，星期天

一、生物学性状第5页,共46页，2024年2月25日，星期天1.形态与染色肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛头状，成双排列，少呈链状。在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。第6页,共46页，2024年2月25日，星期天第7页,共46页，2024年2月25日，星期天第8页,共46页，2024年2月25日，星期天第9页,共46页，2024年2月25日，星期天2.培养特点（1）培养基肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚血液平板（

5％马血或羊血）。第10页,共46页，2024年2月25日，星期天（2）分离培养1）标本处理

及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。第11页,共46页，2024年2月25日，星期天2）选择性分离培养基培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。第12页,共46页，2024年2月25日，星期天3）培养环境

5～10％CO2、35℃培养24～48h。第13页,共46页，2024年2月25日，星期天（3）肺炎链球菌的菌落形态在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。第14页,共46页，2024年2月25日，星期天第15页,共46页，2024年2月25日，星期天第16页,共46页，2024年2月25日，星期天第17页,共46页，2024年2月25日，星期天肺炎链球菌第18页,共46页，2024年2月25日，星期天肺炎链球菌第19页,共46页，2024年2月25日，星期天第20页,共46页，2024年2月25日，星期天肺炎链球菌第21页,共46页，2024年2月25日，星期天3.抗原结构（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。第22页,共46页，2024年2月25日，星期天二、肺炎链球菌鉴定肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。必要时可作荚膜肿胀试验或小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。也可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。第23页,共46页，2024年2月25日，星期天肺炎链球菌鉴定要点

革兰阳性双球菌，矛头状，不呈链；血平皿菌落呈草绿溶血，湿润，菌落表面无小白点；培养时间长出现脐窝状；胆汁溶解试验阳性；荚膜肿胀试验阳性；乳胶单克隆抗体凝集阳性。第24页,共46页，2024年2月25日，星期天1.溶血性检查肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。第25页,共46页，2024年2月25日，星期天2.Optochin(OP，奥普托欣)敏感试验该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。optochin敏感试验方法是药敏试验。挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5μg/片的optochin纸片，置5~10%CO2的大气中（或烛缸），35℃孵育过夜。抑菌环直径>=14mm为敏感，推断为肺炎链球菌。抑菌环直径<14mm时参照胆汁溶菌试验。肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上，甲型溶血性链球菌（约98%）小于12mm。

第26页,共46页，2024年2月25日，星期天

也有例外，我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链球菌，并发现大多数的缓症链球菌和部分口腔链球菌对optochin的抑菌环直径>=14mm。应注意鉴别。但大多数肺炎链球菌对苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而缓症链球菌和口腔链球菌对OX耐药。这可作为辅助鉴别点。第27页,共46页，2024年2月25日，星期天第28页,共46页，2024年2月25日，星期天肺炎链球菌第29页,共46页，2024年2月25日，星期天肺炎链球菌第30页,共46页，2024年2月25日，星期天第31页,共46页，2024年2月25日，星期天第32页,共46页，2024年2月25日，星期天3.胆汁溶菌试验

自溶酶是一种L-丙氨酸--N-乙酰胞壁酰胺酶，能切断肽聚糖上L-丙氨酸与N-乙酰胞壁酸间的连接键，从而破坏细胞壁，使菌溶解。自溶酶在菌生长的稳定期被激活，也可被胆汁或胆盐等活性物质激活，从而促进培养物中的菌体溶解。肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性，甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。第33页,共46页，2024年2月25日，星期天

（1）试管法:

取新鲜培养物分装于两支试管内（每支1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。第34页,共46页，2024年2月25日，星期天第35页,共46页，2024年2月25日，星期天

（2）平皿法:

加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。第36页,共46页，2024年2月25日，星期天第37页,共46页，2024年2月25日，星期天第38页,共46页，2024年2月25日，星期天胆溶阴性第39页,共46页，2024年2月25日，星期天4.乳胶凝集试验结果准确、快速、特异性高。第40页,共46页，2024年2月25日，星期天第41页,共46页，2024年2月25日，星期天第42页,共46页，2024年2月25日，星期天5.荚膜肿胀试验

取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美蓝液混合后加盖片，室温10~20min后，用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。第43页,共46页，2024年2月25日，星期天6.凝集试验

包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白A）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。第44页,共46页，2024年2月25日，星期天表1非β溶血链球菌的鉴别————————————————————————————————————菌种Optochin胆汁胆汁6.5%NaCl吡咯烷卫星现象CAMP血清群敏感溶菌七叶苷肉汤酮酶————————————————————————————————————肺炎链球菌++——————牛链球菌——+————D无乳链球菌———d——+B草绿色链球菌————————营养变异链球菌————++——————————————————————————————————————*d.不同菌株第