DNA高级结构、理化性质及应用2【可编辑的文档】

一、DNA的双螺旋结构及其意义

1953年，Watson和Crick发现了DNA双螺旋（doublehelix)结构模型。

DNA双螺旋结构要点：(Watson和Crick，1953)DNA由两条反相平行的脱氧核苷酸链组成，脱氧核糖-磷酸骨架位于双链的外侧，碱基位于内侧，双链的碱基之间以氢键相结合。（碱基互补配对形式：A

T；GC)2.DNA是右手螺旋结构，螺旋直径为2nm，螺距为3.4nm。碱基平面垂直螺旋轴，相邻碱基平面距离为0.34nm，螺旋一圈包含10对碱基。3.氢键维持DNA双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。图1-8DNA双螺旋结构示意图上述Watson和Crick的DNA双螺旋结构称为B型结构，是DNA分子在生理条件下最稳定的结构，如果改变溶液的离子强度或相对湿度，DNA螺旋结构的上述特征就会发生变化。右手螺旋，11碱基/螺旋右手螺旋，10碱基/螺旋左手螺旋，12碱基/螺旋可能参与基因的表达和调控

DNA双螺旋结构不同构型的意义并不在于其螺旋直径及其高度的变化，关键是由于这些变化而引起的表面结构的改变，进而影响其生物学功能。

DNA双螺旋的这种表面结构有助于DNA结合蛋白识别并结合特定的DNA序列。而这种表面构型的变化对基因组DNA与其DNA结合蛋白的特异性相互作用具有重要的意义。二、其它类型的DNA高级结构1、三股螺旋DNA

三股螺旋DNA也称三链DNA（triplestrandDNA,tsDNA),其结构是在DNA双螺旋结构的基础上形成。双螺旋通过Watson-Crick氢键稳定，而三股螺旋沿需通过Hoogsteen氢键稳定。三条链均为同型嘌呤（homopurine,Hpu)或同型嘧淀（homopyrimidine,Hpy),即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶。

根据三链的组成和相对位置分为两种基本类型：嘌呤-嘌呤-嘧啶型（Pu-Pu-Py型)：嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Py-Pu-Py型)：——在碱性介质中稳定——在偏酸性介质中稳定三链中的两条链为正常双螺旋，第三条嘧啶链位于双螺旋的大沟中，并随双螺旋结构一起旋转。三链中碱基配对符合Hoogsteen模型：在Py-Pu-Py型中为：T=A=T、C+=G=C（与G形成Hoogsteen键的C必须质子化）；在Pu-Pu-Py中为：G=G=C、A=A=T

当DNA双链中含有H-回文序列时，即某区段DNA两条链分别为Hpu和Hpy，并且各自为回文结构时，任一条回文结构的5’

和3’部分都可以形成分子内三股螺旋及剩余的半条回文游离单链。在一定条件下，含回文序列DNA还可形成小瘤DNA（noduleDNA),它在中性溶液中稳定。

真核生物基因组中存在大量可形成三链DNA的多聚嘌呤核苷酸和多聚嘧啶核苷酸序列。这些序列有的存在于调控区，有的位于DNA复制的起点或终点，有的则位于染色体重组位点，提示它们可能与基因的表达调控、DNA的复制及染色体的重组有关。2、十字型结构

十字型结构的分子基础是DNA分子中存在翻转重复序列。此时不仅两条链互补。单链中的翻转重复区也可以互相配对形成双链分子。

DNA变性后或因其他原因引起DNA分子两条链分开，再复性时翻转重复区的DNA可以自我配对，形成突出于双链之外的发夹结构，两个并列的发夹形成十字结构。5’TCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAGGCCGTTTGTTTGTGGGCGACCATCGCCACCAAAAAAACAAACG5’GGTTACGGCCGCGATCGCGATATATTATATAGCGCTAGCGCCGGCATCAC5’---TCCGGCAAACTTTTGTTTGC------AGGCCGTTTGAAAACAAACG---5’

与DNA双螺旋结构相比,十字形结构中氢键形成减少,而且失去了双螺旋DNA碱基堆积力的相互作用,因而稳定性不如双螺旋DNA.

十字形结构可能在基因表达调控中起作用,但其确切的生物学功能有待研究.3.DNA的超螺旋结构

DNA双螺旋进一步盘曲形成更加复杂的结构称为DNA的三级结构,即超螺旋结构.

正超螺旋:DNA的盘曲方向与DNA双螺旋方向相同.

负超螺旋:DNA的盘曲方向与DNA双螺旋方向相反.(1)(2)核小体核心组蛋白第一层次折叠，体积减少6倍。第二层次折叠，直径30nm纤丝，每周6个核小体，致密度增加40倍。第三层次折叠，30nm纤丝折叠成柱状结构致密度增加约1000倍。在分裂期的染色体中，约1m长的DNA分子约压缩8000-10000倍，容纳于直径只有数微米的细胞核中。超螺旋可能有两方面的生物学意义:

超螺旋DNA比松驰型DNA更紧密,使DNA分子体积变得更小,对其在细胞的包装过程更为有利;

超螺旋能影响双螺旋的解链程序,因而影响DNA分子与其他分子(如酶、蛋白质）之间的相互作用。三、DNA的理化性质及应用(一)双链DNA单链DNA(二)

在DNA解链过程中，由于更多的共轭双键得以暴露，DNA在紫外区260nm处的吸光值增加，并与解链程度有一定的比例关系，这种关系称为DNA的增色效应。

(三)四、核酸分子杂交的应用1、RNA酶保护分析（RibonucleaseProtectionAssay,RPA)

RPA是以液相杂交为基础发展起来的，可用于基因和mRNA的结构分析以及mRNA的定量研究。

其原理为：在体外经转录合成一个带有标记的单链RNA探针，此探针与待测RNA在序列上互补，二者杂交后，用RNA酶处理，未形成双链的RNA单链被水解成单核苷酸，杂交形成的双链RNA受到保护，不被降解，然后通过电泳进行RNA-RNA杂交体的检测。

RPA的检测方法十分灵敏，结果可靠，是进行mRNA定量、mRNA末端定位以及确定内含子位置的常用方法。总RNA标记探针杂交RNA酶水解灭活RNA酶沉淀RNAPAGE电泳膜转移与生物素探针杂交洗膜、封闭膜与抗生物素蛋白-碱性磷酸酶一起孵育加入发光剂X光片曝光RNA酶保护分析示意图：2、滤膜杂交：滤膜杂交是固相杂交的一种，是将待测核酸分子结合到不同的滤膜上，然后同存在于液相中的标记探针进行杂交。待测核酸样品可以直接点在滤膜上（称为斑点杂交）；也可以先将核酸样品经琼脂糖凝胶电泳分离，再通过印迹技术将核酸从凝胶中按原来的位置和顺序转移到滤膜上。这样可以比较准确地保持待测核酸片段在电泳图谱中的位置，同时又可以进行分子量测定。这一技术通常用于DNA的限制性内切酶图谱分析、判断DNA的限制性内切酶片段长度多态性以及DNA的定性、定量等研究。3、原位杂交(insituhybridization)：原位杂交是用标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交.这一方法可以保持组织或细胞的完整结构,因此可以精确地进行DNA或RNA在组织或细胞内的定位.此外,结合共聚焦显微镜的应用,这一方法还可以将特异的基因或DNA片段经荧光标记后在染色体上进行定位(fluorescenceinsituhybridization,FISH).4、DNA芯片(DNAchips)：

DNA芯片技术是近年来发展起来的一项融合分子生物学与微电子等多学科的高新技术.其基本原理类似于原位杂交.在特定的固相支持物表面(常用计算机硅芯片)原位合成寡核苷酸,或者将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有顺序地固化于支持物表面经荧光、生物素或放射性核素标记的核酸样品与之杂交具有与芯片DNA序列互补的核酸样品即可与芯片上的探针结合通过对杂交信号的检测分析，便可以得到样