层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识

层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识一、实验目的和内容

目的：1.掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；

2.熟悉凝胶层析的一般过程；

3.了解凝胶介质的选择原则和应用领域。

内容：1.SephadexG-50凝胶柱的装填；

2.凝胶柱柱效测定；

3．凝胶再生的方法。

二、实验仪器和试剂

1.实验仪器

层析柱（1×40cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管

2.实验材料和试剂

SephadexG-50，0.02mol/LpH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）

三、实验步骤

清洗层析柱

测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积

根据SephadexG-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量

称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02mol/LPBS

在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去

用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出

关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液

（重复使用的填料，从此步开始）

边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降

等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积

待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口

通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1mL/min)

始终保护凝胶上端有一段液体

准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪

打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切

沿管壁将5%丙酮溶液0.6mL小心加到凝胶床面上，应避免

将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）

打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子

按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次

加入3－4mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽

将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置

洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1mL/min流速洗脱，记录tr(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）

柱效计算公式：N=5.54•［θr/(W1/2)］2

其中，θr为平均洗脱时间，W1/2为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到1mm。

[SephadexG-100每米理论塔板数为3000～6000]

四、注意事项

1.各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。

2.装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。

3.始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。

4.所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。

五、演示

（一）核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法

1.在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。

2.接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。

3.将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。

4.按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。

5.把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0”，同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在"0"位。

6.上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。

7.测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。

记录仪光吸收A读数

当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半(50%刻度)位置时即为0.25A。

数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)

当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。

当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:

A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A

A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A

（二）部分收集器的操作方法：

1.将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢"和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。

2.定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或“顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在“顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。

七、背景资料

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。

凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子,也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。以下对凝胶层析的使用进行具体介绍。

图1凝胶层析的原理

（一）层析柱

层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用20-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱(一般制备用凝胶柱，直径大于2cm,但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上)。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1m。⑴分组分离时用短柱，一般凝胶柱长20－30cm，柱高与直径的比较5:1─10:1，样品溶液体积应小于凝胶床体积为的20%。⑵分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1（层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000），样品溶液体积应小于凝胶床体积为的5%。⑶脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的20—25%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。

（二）凝胶的类型

常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下：种类及主要用途化学组成部分型号颗粒大小（/目数）分离性能（Da）溶胀时间/h20-25℃90-100℃葡聚糖凝胶（SephadexG-）由葡聚糖和甘油基通过醚桥交联而成G-10100-200＜70031G-15120-200＜150031G-2550-400100-5,00031G-5050-400500-30,00031G-75120-4001,000-8,000243G-100120-4001,000-15,000723G-150120-4001-200120-4001,000-60,000725聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gelp-）由丙烯酰胺和双丙烯酰胺共聚而成P-250-400200-1,80042P-450-400800-4,00042P-650-4001,000-6,00042P-1050-4001,500-20,00042P-3050-2002,500-40,000123P-6050-2003,000-60,000123P-10050-2005,000-100,000245P-15050-20015,000-150,000245P-20050-20050,000-20,000485P-30050-20060,000-400,000485琼脂糖凝胶（Sepharosegio-gel）由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接而成，为中性琼脂糖A0.5m50-400＜10,000-500,000

A1.5m50-400＜10,000-1,500,000

A5m50-40010,000-5,000,000

A15m50-40010,000-15,000,000

A50m50-400100,000-50,000,000

A150m50-2001,000,000-150,000,000

（三）凝胶的选择

根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-200的吸水量为20，1克SephadexG─200吸水后形成的凝胶体积约40mL。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的SephadexG-200效果好；脱盐用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

（四）凝胶的制备

商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。

（五）样品溶液的处理

样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短柱除去。样品的粘度不能太大，否则影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。

（六）防止微生物的污染

交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：

（1）叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20℃时约为40%。它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性，但可干扰荧光标记蛋白质。

（2）可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。

（3）乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.01%。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。

（4）苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001%-0.01%。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。

除了直接加入抑菌剂，在位消毒（Sanitization-in-place,SIP）和在位清（Cleaning-in-place，CIP）对层析介质和仪器的保养十分重要。SIP的目的是将微生物感染减到最低，绝大多数的微生物可用0.5-1MNaOH以该凝胶的建议流速洗约0.5-1小时消除。CIP的目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。凝胶在使用十次以后，最少做一次CIP。事实上，做CIP时，往往已经包含了SIP，不必再重复。