DB32T3775-2020猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法

ICS65.020.20

B31

DB32

江苏省地方标准

DB32/T3775—2020

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测

方法

RT-LAMPmethodforDetectiongPorcineReproductiveandRespiratory

SyndromeVirus

2020-04-08发布2020-05-15实施

江苏省市场监督管理局发布

DB32/T3775—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由南京农业大学提出并归口。

本标准起草单位：南京农业大学。

本标准主要起草人：姜平、张日腾、白娟、熊富强、王先炜、李玉峰、陈闻。

II

DB32/T3775—2020

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法

1范围

本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测原理、试剂和仪器设备、检测程序和结果判

定。

本标准适用于猪临床样品（肺脏、脾脏和血清）和细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测；

同时适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒经典型、高致病性、类NADC30型三种基因亚型的分型检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫。

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3缩略语

PRRSV:porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，猪繁殖与呼吸综合征病毒

LAMP：loop-mediatedisothermalamplification,环介导的恒温扩增

RT-LAMP：Reversetranscription,loop-mediatedisothermalamplification，反转录环介导的恒温扩增。

4原理

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要引起猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病)。该病毒有美洲

型和欧洲型两个血清型。美洲型又有多个基因亚型。我国流行的美洲型PRRSV主要有传统型、高致病

性和类NADC30型毒株，其主要区别存在于病毒的Nsp2基因。环介导的恒温扩增（LAMP）是一种体

外恒温核酸扩增技术，用于快速检测DNA。RT-LAMP是一种逆转录LAMP，用于检测RNA。本标准

RT-LAMP，根据PRRSV开放阅读框架7（ORF7）基因序列、ORF1a（非结构蛋白Nsp2）基因序列设

计4组引物，建立4种RT-LAMP检测方法（即LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4)，其中LAMP1

的特异性引物识别ORF7基因，LAMP2、LAMP3和LAMP4的特异性引物识别Nsp2基因。每种LAMP

引物均包括两对内、外引物（内引物FIP与BIP，外引物F3与B3）和一对环引物（LF与LB）。利用

Bst酶启动循环链置换反应，启动互补链合成，通过在同一链上互补序列周而复始形成有很多环状结构

的茎环DNA混合物，在恒温条件下完成核酸扩增反应。从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的

Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。

该检测方法简便快速、敏感特异，不需要昂贵的仪器设备。

1

DB32/T3775—2020

5试剂和仪器设备

5.1试剂要求

除有特殊说明外，所有生化试剂均为分析纯。RNA提取相关试剂或用品均需经无RNA酶处理。

5.2引物

PRRSVLAMP检测引物和PRRSV毒株基因亚型鉴别LAMP引物，人工合成（基因序列见附录B.1）。

5.3通用试剂

裂解液（TRIZOL）；氯仿；0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）（见附录A.1）；DEPC处理水（见

附录A.2）；异丙醇；75%乙醇；耐热M-MLV（RNaseH-）反转录酶；pMD18-T载体；胶回收试剂盒（Qiagen）；

质粒DNA提取试剂盒（TaKaRa）；PCR试剂（Promega）。

5.4LAMP试剂

——10×BstDNA聚合酶缓冲液（见附录A.3）；

——100mmol/LMgSO4；

——10mmol/LdNTPs（dATP,dCTP,dTTP,dGTP)；

——8U/µLBstDNA聚合酶；

——5mol/L甜菜碱（Betaine）；

——灭菌双蒸水。

——SYBRGreenI染料，1000×。

5.5阴性及阳性对照

5.5.1阴性对照

pMD18-T空载体质粒。

5.5.2阳性对照

LAMP1阳性对照为pMD-BB-N质粒（含高致病性PRRSVBB0907毒株ORF7基因）；LAMP2阳性对

照为pMD-S1-Nsp2质粒（含传统型PRRSVS1毒株Nsp2基因）；LAMP3阳性对照为pMD-BB-Nsp2质粒（含

高致病性PRRSVBB0907毒株Nsp2基因）；LAMP4阳性对照为pMD-FJ-Nsp2质粒（含类NADC30PRRSV

FJ1402毒株Nsp2基因）。

5.6仪器

高速冷冻离心机，恒温水浴锅，微量移液器（0.5μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL），

PCR仪，EP反应管（0.5mL、1.5mL），组织匀浆器或研钵。

6检测程序

6.1样品处理

按照NY/T541动物疫病实验室检验采样方法，采集待检猪的肺脏、脾脏和血清等样品。肺脏、脾

脏取约1g，剪碎后按1:3（V/V）加入PBS（0.01mol/L，pH7.2），充分匀浆呈悬液。血清制备方法为：血

2

DB32/T3775—2020

液（不加抗凝剂）室温静置2h~3h后，4000r/min离心5min，取上清液置于EP管内。处理好的匀浆悬

液和血清于-20℃保存备用。

样品RNA制备按照经验证的RNA提取方法或等效的商品化RNA提取试剂盒，按照其使用说明操

作。提取的RNA应在2h内进行反转录或放置于-20℃保存备用。

6.2反转录（cDNA的合成）

配制反转录反应体系19µL，含M-MLV5×Reactionbuffer（含Mg2+）4µL；2.5mol/LdNTPs1µL；

Olige（dT）1µL，RNA酶抑制剂0.5µL；DEPCddH2O5.5µL,RNA7μL，70℃水浴5min后置冰上冷

却至37℃，再加入1.0µL反转录酶M-MLV，42℃水浴1h得cDNA，用于下面LAMP扩增，或-20℃

冻存备用。

6.3LAMP检测方法

6.3.1反应体系

采用四管两步RT-LAMP检测方法进行。

第一步（1管）：采用LAMP1通用引物（见附录B.1），检测所有PRRSV毒株。

第二步（3管）：对第一步检测结果为阳性的样本，采用LAMP2、LAMP3和LAMP4引物（见附录B.1），

用3个EP管，同时进行LAMP，鉴别不同基因亚型PRRSV。

四个反应管反应体系相同，总体积25μL，具体反应体系如下：

10×BstDNA聚合酶缓冲液（见附录A.3）2.5µL

MgSO4（4μmol/L）1.5µL

2.5mMdNTPs3.5µL

甜菜碱（Betaine）2.0µL

外引物F3/B3（4μmol/L）各1.0µL

内引物FIP/BIP（40μmol/L）各1.0µL

环引物LF/LB（10μmol/L）各1.0µL

BstDNA聚合酶(8U)1.0µL

耐热M-MLV反转录酶1.0µL

cDNA模板1.5µL

双蒸水6.0µL

总计

25µL

但其中的引物不同，分别是LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4引物（见附录B.1）。每次检测应分

别设立阴性和阳性对照样品管。LAMP1阳性对照为pMD-BB-N，LAMP2阳性对照为pMD-S1-Nsp2，

LAMP3阳性对照为pMD-BB-Nsp2，LAMP4阳性对照为pMD-FJ-Nsp2质粒DNA，阴性对照为pMD18-T空

载体质粒DNA。

在EP管的管盖上滴加1000×SYBRGreenⅠ染料1.0μL，再轻轻地把盖子盖紧。

6.3.2反应条件

将反应管混匀，置64±1℃扩增40min且保证管盖上的SYBRGreenI不进入反应物。

3

DB32/T3775—2020

7结果判定

7.1PRRSV阴阳性判定

反应结束后，将LAMP1反应管12000r/min，离心1min，轻轻混匀，观察颜色变化，绿色为阳性，

淡黄色为阴性。

7.2PRRSV基因亚型的类型判定

在阴性对照、阳性对照符合时，判定样品检测结果（参见附录B.2）。

若LAMP1结果为阳性，则判定是PRRSV阳性，否则判定为PRRSV阴性。

若LAMP2检测为阳性，LAMP3、LAMP4检测为阴性，则判定是PRRSV经典型毒株。

若LAMP3检测为阳性，LAMP2、LAMP4检测为阴性，则判定是PRRSV高致病性毒株。

若LAMP4检测为阳性，LAMP2、LAMP3检测为阴性，则判定是PRRSV类NADC30型毒株。

8安全和防污染措施

8.1检测废弃物等实验室安全防护按GB19489和SN/T1193的规定执行。

8.2检测过程中防止污染措施按GB/T27401的规定执行。

8.3实验前后，实验室用紫外线消毒。

4

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AA

附录A

（规范性附录）

试剂配制

A.10.01mol/L（pH7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）

A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·2H2O27.6g，先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水

稀释至1000mL。

B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·12H2O71.6g（或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用适量蒸

馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。

A液14mL，B液36mL，加氯化钠（NaCl）8.5g，最后用蒸馏水定容至1000mL；121℃，15min

高压灭菌，4℃保存备用。

A.2DEPC处理水

用0.1%DEPC处理后的蒸馏水（DEPC与蒸馏水1:1000混合），经121℃15min高压处理，用于溶

解RNA。

A.310×BstDNA聚合酶缓冲液

含200mmol/LTris-HCl，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1%Triton-100，

pH8.8，25℃保存。

5

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BB

附录B

（资料性附录）

引物序列

B1PRRSVLAMP检测引物和PRRSV毒株基因亚型鉴别LAMP引物序列，见表B.1。

表B.1LAMP引物序列

引物种类引物名称序列bp

通用引物G-F3AGAAAAACCCGGAGAAGCC140-156

LAMP1G-B3TGCTGAGGGTGATGCTGT352-369

G-FIPACAATTGCCGCTCACTAGGGGTTTTCCATTTCCCTCTTGCGACT157-177

203-223

G-BIPCGCTGGAACTTGTGCCCTGTTTTTGCACAGTATGTTGCGTAGGC258-277

318-337

G-LFGTGATGCCTGACGTCATCTTC178-198

G-LBGGGAGGATAAGTTACACTGTGGA286-308

BB-NFATGCCAATAATAACGGCAAGCA0-22

RTCATGCTGAGGGTGATGCTGT351-371

经典毒株C-F3ACCGCAATGCATCTTCAGG1523-1546

LAMP2C-B3GTCTGTGAGGAAGCAGACAA1723-1743

C-FIPTCGGCTCACTCAAGGGTGTCATTTTAGTGAGCCGGCTCCAATT1561-1578

1611-1619

C-BIPGCACCGCGGCGTAAGTTTCATTTTGTTCTGGTACGGTGGGATTG1642-1662

1692-1711

C-LBGCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGC1664-1686

S1-Nsp2FAGCTGGTGATTGTGTCCTCA1500-1520

RCTCTACTCCCAGAACGCCCCC1780-1800

高致病性毒H-F3TTGAGGCGGCGAATCAGA887-905

株LAMP3H-B3CCAGGACAACCTCTTCCAAC1077-1096

H-FIPCCTTGCCCAAAGGCTCTTGAGTTTTTAACCGGACAACCTCACGT906-923

955-976

H-BIPTGACCGCCTTCTCACTGTCCATTTTCCTCTCACGGTGATGAACCT988-1008

1037-1054

H-LFCAGGGTGCAGCATGAGTTG925-943

H-LBTGCTATTACCCTGCACAAGGTG1012-1033

BB-Nsp2FTTGAGGAATGCTTGGCCAA800-818

RTCGACCTGCTCAGCCGCCCGGGCCA1126-1250

类NADC30N-F3TTGTGCTTCCTGGGGTTG871-891

毒株LAMP4N-B3AACTACCACACCTGGACCT1384-1399

N-FIPGCCATGACAGAAACTGGAGCGTTTTTGAGGCTGCTCAAGCAACG893-910

934-957

N-BIPAAGCGGAGTCTGTCAGGAGCCTTTTGATCTTTCTGCGTGGGGC1321-1343

1365-1384

N-LFTGGTTGATAGGGGGCAGTTC912-927

N-LBTCCAGAGAGCAGGCCTCT1343-1363

FJ-Nsp2FTGAAGAATGCTTGGCTAGGCT800-820

RCTACGCTTGACAGGGAGCT1481-1500

6

DB32/T3775—2020

B.2RT-LAMP结果示图

RT-LAMP检测结果示图B.1

图B.1RT-LAMP检测方法染料染色图

1.阳性样品（+）

2.阳性对照（+）

3.阴性对照（-）

______________

7

DB32/T3775—2020

目次

前言.........................................................................................................................................................Ⅰ

1范围...........................................................................................................................................................1

2规范性引用文件.......................................................................................................................................1

3缩略语.......................................................................................................................................................1

4原理...........................................................................................................................................................1

5试剂和仪器设备.......................................................................................................................................2

6操作程序...................................................................................................................................................2

7结果判定...................................................................................................................................................4

8安全和防污染措施...................................................................................................................................4

附录A（规范性附录）试剂的配制.................................................................................................5

附录B（资料性附录）.......................................................................................................................6

I

DB32/T3775—2020

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法

1范围

本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测原理、试剂和仪器设备、检测程序和结果判

定。

本标准适用于猪临床样品（肺脏、脾脏和血清）和细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测；

同时适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒经典型、高致病性、类NADC30型三种基因亚型的分型检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫。

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3缩略语

PRRSV:porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，猪繁殖与呼吸综合征病毒

LAMP：loop-mediatedisothermalamplification,环介导的恒温扩增

RT-LAMP：Reversetranscription,loop-mediatedisothermalamplification，反转录环介导的恒温扩增。

4原理

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要引起猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病)。该病毒有美洲

型和欧洲型两个血清型。美洲型又有多个基因亚型。我国流行的美洲型PRRSV主要有传统型、高致病

性和类NADC30型毒株，其主要区别存在于病毒的Nsp2基因。环介导的恒温扩增（LAMP）是一种体

外恒温核酸扩增技术，用于快速检测DNA。RT-LAMP是一种逆转录LAMP，用于检测RNA。本标准

RT-LAMP，根据PRRSV开放阅读框架7（ORF7）基因序列、ORF1a（非结构蛋白Nsp2）基因序列设

计4组引物，建立4种RT-LAMP检测方法（即LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4)，其中LAMP1

的特异性引物识别ORF7基因，LAMP2、LAMP3和LAMP4的特异性引物识别Nsp2基因。每种LAMP

引物均包括两对内、外引物（内引物FIP与BIP，外引物F3与B3）和一对环引物（LF与LB）。利用

Bst酶启动循环链置换反应，启动互补链合成，通过在同一链上互补序列周而复始形成有很多环状结构

的茎环DNA混合物，在恒温条件下完成核酸扩增反应。从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的

Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。

该检测方法简便快速、敏感特异，不需要昂贵的仪器设备。

1

DB32/T3775—2020

5试剂和仪器设备

5.1试剂要求

除有特殊说明外，所有生化试剂均为分析纯。RNA提取相关试剂或用品均需经无RNA酶处理。

5.2引物

PRRSVLAMP检测引物和PRRSV毒株基因亚型鉴别LAMP引物，人工合成（基因序列见附录B.1）。

5.3通用试剂

裂解液（TRIZOL）；氯仿；0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）（见附录A.1）；DEPC处理水（见

附录A.2）；异丙醇；75%乙醇；耐热M-MLV（RNaseH-）反转录酶；pMD18-T载体；胶回收试剂盒（Qiagen）；

质粒DNA提取试剂盒（TaKaRa）；PCR试剂（Promega）。

5.4LAMP试剂

——10×BstDNA聚合酶缓冲液（见附录A.3）；

——100mmol/LMgSO4；

——10mmol/LdNTPs（dATP,dCTP,dTTP,dGTP)；

——8U/µLBstDNA聚合酶；

——5mol/L甜菜碱（Betaine）；

——灭菌双蒸水。

——SYBRGreenI染料，1000×。

5.5阴性及阳性对照

5.5.1阴性对照

pMD18-T空载体质粒。

5.5.2阳性对照

LAMP1阳性对照为pMD-BB-N质粒（含高致病性PRRSVBB0907毒株ORF7基因）；LAMP2阳性对

照为pMD-S1-Nsp2质粒（含传统型PRRSVS1毒株Nsp2基因）；LAMP3阳性对照为pMD-BB-Nsp2质粒（含

高致病性PRRSVBB0907毒株Nsp2基因）；LAMP4阳性对照为pMD-FJ-Nsp2质粒（含类NADC30PRRSV

FJ1402毒株Nsp2基因）。

5.6仪器

高速冷冻离心机，恒温水浴锅，微量移液器（0.5μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL），

PCR仪，EP反应管（0.5mL、1.5mL），组织匀浆器或研钵。

6检测程序

6.1样品处理

按照NY/T541动物疫病实验室检验采样方法，采集待检猪的肺脏、脾脏和血清等样品。肺脏、脾

脏取约1g，剪碎后按1:3（V/V）加入PBS（0.01mol/L，pH7.2），充分匀浆呈悬液。血清制备方法为：血

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DB32/T3775—2020

液（不加抗凝剂）室温静置2h~3h后，4000r/min离心5min，取上清液置于EP管内。处理好的匀浆悬

液和血清于-20℃保存备用。

样品RNA制备按照经验证的RNA提取方法或等效的商品化RNA提取试剂盒，按照其使用说明操

作。提取的RNA应在2h内进行反转录或放置于-20℃保存备用。

6.2反转录（cDNA的合成）

配制反转录反应体系19µL，含M-MLV5×Reactionbuffer（含Mg2+）4µL；2.5mol/LdNTPs1µL；

Olige（dT）1µL，RNA酶抑制剂0.5µL；DEPCddH2O5.5µL,RNA7μL，70℃水浴5min后置冰上冷

却至37℃，再加入1.0µL反转录酶M-MLV，42℃水浴1h得cDNA，用于下面LAMP扩增，或-20℃

冻存备用。

6.3LAMP检测方法

6.3.1反应体系

采用四管两步RT-LAMP检测方法进行。

第一步（1管）：采用LAMP1通用引物（见附录B.1），检测所有PRRSV毒株。

第二步（3管）：对第一步检测结果为阳性的样本，采用LAMP2、LAMP3和LAMP4引物（见附录B.1），

用3个EP管，同时进行LAMP，鉴别不同基因亚型PRRSV。

四个反应管反应体系相同，总体积25μL，具体反应体系如下：

10×BstDNA聚合酶缓冲液（见附录A.3）2.5µL