3.2+基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第二节、基因工程的基本操作程序教学目标1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。2.针对人类生产或生活中的某一需求,选取适当的基因工程的技术和方法,尝试设计获得某一转基因产品的方案。3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。从社会中来1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉与普通棉花1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定3.2基因工程的基本操作程序（四个步骤）如从苏云金杆菌提取的Bt抗虫蛋白基因就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因一、目的基因的筛选与获取①概念：在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物的基因。阅读教材76页相关内容，回答下列问题：什么是目的基因，主要是指哪一类基因？举例说明？根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因②类型:1.目的基因:如何筛选目的基因？从哪里获得目的基因呢？明确了目的基因后，该怎样获取它呢？2.筛选目的基因的依据：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。①人工合成②基因文库③PCR扩增3.获取目的基因方法：在目的基因的核苷酸序列已知的情况下常利用PCR特异性的快速扩增目的基因4.利用PCR获取和扩增目的基因:（1）PCR的全称：聚合酶链式反应（3）PCR原理：DNA半保留复制（2）PCR定义及发明人：参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶(体外用高温代替)打开DNA双链DNA母链提供DNA复制模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸（4）DNA复制所需基本条件：（5）PCR反应需要哪些条件？①一定的缓冲液（一般要加Mg2+__激活DNA聚合酶）②DNA模板③分别与两条模板链结合的2种引物（人工合成的与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸）使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸.PCR为人工合成的单链DNA，细胞内DNA复制引物为RNA。④4种脱氧核苷酸必须有目的基因上一段已知序列,以便设计引物实际加入的是四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP,提供原料的同时提供能量，不需要加入ATP。⑤耐高温的DNA聚合酶⑥控制温度（6）扩增的过程：一般分为变性、复性、延伸三步变性:90℃以上,双链DNA解旋为单链复性:当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸:温度上升到72℃左右时，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链即将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物（6）扩增的过程：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n

，n为扩增循环的次数）（7）扩增特点：例如：1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要（24-1）×2=30个引物。2×（2n-1）成指数形式扩增（8）仪器：PCR扩增仪（9）鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶，边解旋边复制高温解旋，双链完全分开场所主要在细胞核内细胞外(PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件高温结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因相同原则碱基互补配对条件原料、模板、能量、酶、引物子链延伸方向5′端到3′端（从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸）5、人工合成法：适用对象：基因比较小、核苷酸序列已知方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因6、基因文库获取：（目的基因的核苷酸序列未知）（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库（2）基因文库类型：（包含一种生物的所有基因）（包含一种生物的一部分基因）（3）基因组文库与cDNA文库的构建过程比较基因组文库（以原核生物为主）cDNA文库（真核生物）某生物体内全部DNA某种生物某个时期的mRNA旁栏思考题1.用PCR技术可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另DNA链，形成双链DNA分子1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是①双链DNA分子为模板②ATGTG或TACAC模板链③四种脱氧核苷酸④四种核苷酸⑤DNA聚合酶⑥耐高温的DNA聚合酶⑦引物⑧温度变化⑨恒温A．①③④⑦⑨B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨D．①③⑥⑦⑧D2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个B能编码出人们所需要的蛋白质的基因请阅读教材80页相关内容，讨论回答：二.基因表达载体的构建——基因工程的核心工作构建基因表达载体的目的？基因表达载体的组成是什么？分别有何作用？1.目的：②使目的基因能够表达和发挥作用。①使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代2.基因表达载体的组成（是载体的一种）a.目的基因基因表达载体与载体相比增加了目的基因。目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，否则目的基因将无法表达c.启动子d.终止子①位置：是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游②作用：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA①位置：也是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游②作用：终止mRNA的转录。e.复制原点：DNA聚合酶结合位点，复制的起点有时为何会在载体中人工构建诱导型启动子？b.标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用抗性基因作为标记基因原核生物基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核生物基因结构同种或能产生相同黏性末端的限制酶3.基因表达载体的构建过程：质粒（载体）DNA分子一个或两个切口两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子4.基因表达载体构建的过程用到哪些工具？用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)产物有：目的基因—目的基因、目的基因—载体、载体—载体3种工具有：限制酶、DNA连接酶、载体5.构建基因表达载体时选用什么样的限制酶？选用同种限制酶或者能产生相同末端的两种限制酶用两种限制酶同时切割载体和含目的基因的DNA分子可防止目的基因自身环化和反向连接6.基因表达载体的启动子、终止子的作用，与起始密码、终止密码是否相同？基因表达载体的构建会因受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同而有所差别。项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质有特殊序列结构的DNA片段有特殊序列结构的DNA片段mRNA上三个相邻碱基（AUG）mRNA上三个相邻碱基（UAA等）位置基因上游基因下游mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录终止转录翻译的起始点终止翻译2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气也无法确定哪些基因导入了受体植物。旁栏思考题三、将目的基因导入受体细胞（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——钙离子处理法实际导入受体细胞的结构是什么？基因工程常用的受体细胞有哪些？（一）受体细胞：动、植物细胞和微生物细胞（1）花粉管通道法②滴注法：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。我国科学家独创1、将目的基因导入植物细胞受体细胞:体细胞或受精卵①注射器注入法:用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中花粉卵细胞精子花粉管（2）农杆菌转化法②侵染植物类型:能侵染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程③农杆菌的特性：农杆菌能将Ti质粒上的T—DNA（即转移DNA）转移到被侵染的细胞并将其整合到该细胞的染色体DNA上农杆菌转化法利用了农杆菌的什么特性？③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体重组Ti质粒导入植物细胞插入植物细胞染色体的DNA植物组织培养表现新性状的植株转入农杆菌根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

据图可知，目的基因发生了几次拼接和导入？发育体外培养2、将目的基因导入动物细胞②方法:显微注射技术③操作程序:含目的基因的表达载体受精卵显微注射雌性动物的子宫具有新性状的动物①常用受体细胞:受精卵早期胚胎显微注射法胚胎移植让转基因猴全身体细胞都带有目的基因，选择怎样的受体细胞？3、将目的基因导入微生物细胞①常用法：Ca2+处理（感受态细胞法）②常用菌：大肠杆菌③微生物作受体细胞原因：④过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少对受体细胞常用Ca2+处理的目的什么？感受态细胞具有什么特点？Ca2+处理的目的是增大细菌细胞壁的通透性感受态细胞的特点是通透性增强，易吸收DNA实例：利用转基因大肠杆菌生产药物（胰岛素）

原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作为受体细胞吗？不可以，糖蛋白上的糖侧链是在内质网和高尔基体上加工完成的，大肠杆菌不存在这两种细胞器在生产需要加工和分泌的蛋白质时,酵母菌比大肠杆菌有优势。1、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达C2.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A．①②B．②③C．③④D．①④C按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否可以确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确定得到了新的性状？不一定！如何判断？四、目的基因的检测与鉴定1、分子水平的检测检测：③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等②检测目的基因是否转录出mRNA①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因检查转基因生物是否培育成功的一步2、个体生物学水平的鉴定PCR技术检测1、分子水平的检测①方法：DNA分子杂交（DNA与DNA杂交），PCR技术②过程：探针是用放射性同位素或荧光分子等标记的与目的基因互补的特异核苷酸序列（或目的基因的单链DNA片段）（1）检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键：①首先取出转基因生物的基因组DNA；②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。15N15N变性变性基因探针待测DNA知识延伸——DNA分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。（2）检测目的基因是否转录出了mRNA（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：方法：核酸分子杂交（DNA与RNA杂交），PCR技术通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原,制备相应抗体,检测转基因生物的蛋白质,利用抗原与抗体特异性结合的原理。过程：探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA现象：是否出现杂交带抗原-抗体杂交技术鉴定转基因生物培育是否成功有没有更简便、直接的方法？2、个体生物学水平的鉴定抗虫、抗病鉴定（抗虫或抗病的接种实验）活性鉴定等检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是？用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡通过相应病原微生物感染生物来确定相应抗病基因是否赋予了受体生物抗病特性以及抗性的程度。目的基因的检测与鉴定小结：基因工程的基本操作流程图归纳:基因工程的基本操作程序DNA分子杂交技术、分子杂交技术和抗原—抗体杂交技术到社会中去1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转济基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测数据的更科研论文发表，每年学生获得的证据是不一样的。例如，科研人员对长江流域种植的抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集的证据，如科研论文、权威的官方报道等。2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对，他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为几个方面。(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CryIAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%~30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。1.基因工程的基本操作程序有：①目的基因的筛选和获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。2.目的基因主要是指编码蛋白质的基因。其获取方法主要有①利用PCR技术获取②人工合成③基因文库中获取3.基因表达载体由目的基因、启动子、终止子和标记基因等组成。4.将目的基因导入植物细胞的方法有：①农杆菌转化法；②花粉管通道法。5.将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法。6.目的基因的检测方法有DNA分子杂交技术、分子杂交技术和抗原—抗体杂交技术。有时还需进行个体生物学水平的鉴定。核心回扣练习与应用一、概念检测1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。（2）构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（）（3）只要检测出番茄细胞中含有物基因，就代表抗冻番茄培育成功。（

）2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸√××D二、拓展应用1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体