高效液相色谱法电子讲义

高效液相色谱法电子讲义三、色谱流程和仪器第2页,共69页，2024年2月25日，星期天四、HPLC的特点速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用第3页,共69页，2024年2月25日，星期天第二节基本理论一、色谱分离过程（一）液-固吸附色谱流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用的不同来分离物质。第4页,共69页，2024年2月25日，星期天流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂渍于载体上的固定相。（二）液-液分配色谱流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配色谱法流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色谱法第5页,共69页，2024年2月25日，星期天（三）离子交换色谱（四）离子对色谱法（五）分子排阻色谱法第6页,共69页，2024年2月25日，星期天二、色谱流出曲线和保留值（一）色谱流出曲线及相关术语（二）保留值第7页,共69页，2024年2月25日，星期天第8页,共69页，2024年2月25日，星期天三、分离度第9页,共69页，2024年2月25日，星期天第三节定性和定量分析一、定性分析（一）利用已知物对照法定性1、利用保留特性2、利用不同柱比较第10页,共69页，2024年2月25日，星期天（二）色谱法和其他方法结合定性1、利用化学反应定性2、利用二极管陈列检测器3、收集峰的流出物4、HPLC-MS第11页,共69页，2024年2月25日，星期天二、定量分析（一）峰面积或峰高的测量方法1、手测峰高2、峰高乘半峰宽3、剪纸称重4、积分仪测定5、微处理机测定第12页,共69页，2024年2月25日，星期天（二）定量方法1、峰面积归一法2、外标法3、内标法4、内加法（或追加法）第13页,共69页，2024年2月25日，星期天第四节高效液相色谱的分离模式一、基本原理二、分类1、吸附色谱2、分配色谱3、离子交换色谱第14页,共69页，2024年2月25日，星期天4、分子排阻色谱5、亲和色谱三、HPLC在生物大分子中的应用在生物大分子中的HPLC中，体积排阻色谱，离子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离模式。第15页,共69页，2024年2月25日，星期天第五节液-固色谱法液-固色谱法通常称为吸附色谱1、载体：硅胶2、吸附剂吸附试样的能力3、原理第16页,共69页，2024年2月25日，星期天第六节键合相色谱法一、正相色谱法1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团。2、分离机制属于分配色谱3、主要用于分离极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。第17页,共69页，2024年2月25日，星期天二、反相色谱1、分离机理2、固定相3、流动相第18页,共69页，2024年2月25日，星期天第七节离子交换色谱离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团，当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。第19页,共69页，2024年2月25日，星期天

种类阳离子交换树脂强酸性弱酸性阴离子交换树脂强碱性弱碱性第20页,共69页，2024年2月25日，星期天离子交换层析适用性

能在水溶液或含水极性溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。第21页,共69页，2024年2月25日，星期天使用离子交换剂使物质分离表

样品

强酸型(磺酸型)

稀NH4OH洗脱

通过液

酸性、中性化合物解离型、两性化合物

稀NaOH洗脱强碱型(季铵型)强碱型稀HCl洗脱

通过液

通过液

酸性化合物中性化合物解离型物质两性化合物

(盐、生物碱)第22页,共69页，2024年2月25日，星期天一、离子交换色谱的分离机理1、不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。第23页,共69页，2024年2月25日，星期天2、P0：流动相中溶质的浓度Pb：填料表面上被吸附的溶质浓度D0：流动相中洗脱剂的浓度Db：填料表面上洗脱剂的浓度Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目。第24页,共69页，2024年2月25日，星期天①Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数②在Z值不能忽略时第25页,共69页，2024年2月25日，星期天在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K’与保留体积成比例，同时洗脱过程中，Kd，Db是常数，用Kz表示。第26页,共69页，2024年2月25日，星期天3结论二、离子交换色谱的固定相1、高分子类型填料①优点a填料的使用寿命长b具有较高的色谱容量c很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性有利。第27页,共69页，2024年2月25日，星期天②结构以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质，同时也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。③类型MonoBeadsTSK-gelDEAE-5PWSP-5PWCM-5PW第28页,共69页，2024年2月25日，星期天2、无机基质型三、离子交换色谱的流动相1、流动相的PH值①离子交换容量受流动相的PH值影响第29页,共69页，2024年2月25日，星期天②改变流动相PH值，也会影响弱电离的酸性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的保留值。③流动相PH值的变化也能改变分离的选择性④对流动相PH值的控制，通常采用缓冲溶液来实现。第30页,共69页，2024年2月25日，星期天2、流动相的离子强度四、离子交换色谱的影响因素1、填料孔径的影响2、柱长的影响3、流速的影响4、PH值的影响第31页,共69页，2024年2月25日，星期天无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。第32页,共69页，2024年2月25日，星期天5、离子强度的影响第八节体积排阻色谱法一、分离机理1、体积排阻色谱法（SEC）或空间排阻色谱法（SEC）或凝胶色谱法2、凝胶过滤色谱法（GFC）第33页,共69页，2024年2月25日，星期天Sephadex葡聚糖凝胶第34页,共69页，2024年2月25日，星期天3、凝胶渗透色谱法（GPC）4、空间排斥理论①第35页,共69页，2024年2月25日，星期天②V0

死体积，相当于凝胶的粒间体积Vs色谱柱中凝胶的孔穴总体积第36页,共69页，2024年2月25日，星期天二、体积排阻色谱法的特点第37页,共69页，2024年2月25日，星期天三、体积排阻色谱法的固定相（一）固定相的分类1、按固定相基质分类2、按固定相机械强度分类第38页,共69页，2024年2月25日，星期天（二）凝胶固定相的特性参数1、渗透极限2、分离范围第39页,共69页，2024年2月25日，星期天3、固流相比在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为固定相，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积的比值称作固流相比。4、柱效第40页,共69页，2024年2月25日，星期天（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点①物理因素——影响凝胶色谱柱的性能

②扩大分离范围——使用两根以上的串联色谱柱。③更换流动相第41页,共69页，2024年2月25日，星期天谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。①在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度保持不变。②

在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。第42页,共69页，2024年2月25日，星期天四、体积排租色谱法的流动相在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值和分离选择性无影响。①溶解样品的良溶剂②低黏度溶剂③柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀第43页,共69页，2024年2月25日，星期天④控制流动相的PH值和离子强度⑤凝胶渗透色谱——示差折光检测器流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。凝胶过滤色谱——紫外吸收检测器使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。第44页,共69页，2024年2月25日，星期天（一）凝胶渗透色谱的流动相凝胶渗透色谱常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿等有机溶剂作流动相。在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中，四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。第45页,共69页，2024年2月25日，星期天第46页,共69页，2024年2月25日，星期天（二）凝胶过滤色谱的流动相在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同PH值的多种缓冲溶液作流动相。五、体积排租色谱的影响因素1、填料①化学键合的硅胶②亲水树脂凝胶第47页,共69页，2024年2月25日，星期天2、柱长体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。3、洗脱液①以硅胶为基质的填料，PH值范围在2.0-8.0。②键合硅胶如TSK系列凝胶柱在分离蛋白质时保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离子的反应。第48页,共69页，2024年2月25日，星期天a)洗脱液离子强度低时b)洗脱液离子强度低增加到0.3-0.5mol/Lc)常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节d)用氯化钠作离子剂，疏水作用最小e)PH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱第49页,共69页，2024年2月25日，星期天4、流速蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比较理想。5、样品容量进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的分离度。样品的浓度范围一般在0.01%----0.5%.第50页,共69页，2024年2月25日，星期天最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积的1%---3%比较合适。6、蛋白质在变性条件下的分离①变性溶剂如6mol/L盐酸胍、8mol/L脲、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)等有助于精确地确定蛋白质的分子量。②在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到低分子量范围内。第51页,共69页，2024年2月25日，星期天示例：用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定重组人肿瘤坏死因子(rh-TNF)衍生物的相对分子量rh-TNF属基因工程药物，其相对分子量的测定是该药质量控制的主要指标之一。仪器与色谱条件：岛津LC-10AHPLC色谱柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000(30cm×7.5cm)流动相0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4(1:1)+0.05%NaN3流速:1mL/min检测波长:280nm第52页,共69页，2024年2月25日，星期天标准蛋白相对分子量曲线的制备：选用四种蛋白：醛缩酶、血清白蛋白、碳酸酐酶及抑蛋白酶肽制成的混合标样。考虑流速等因素对保留时间T的影响而选用了内标法、既在混合标样中加入右旋糖酐蓝和酪氨酸作为内标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填料孔的两种内标的保留时间T0和Tt，用分配系数Kd对相对分子量对数作图，从而保证结果有良好的重现性。第53页,共69页，2024年2月25日，星期天第54页,共69页，2024年2月25日，星期天样品测定:根据样品的保留时间T求出其分配系数Kd，由Kd从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的lgMr，计算相对分子质量。第55页,共69页，2024年2月25日，星期天第九节亲合色谱法亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特殊物质的一种色谱方法。亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统亲合色谱的专一性与HPLC的快速，稳定，检测方便等优点结合起来。第56页,共69页，2024年2月25日，星期天一、亲合色谱分离机理亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合复合物形成及其解离的过程。第57页,共69页，2024年2月25日，星期天载体LX配基待分离物质第58页,共69页，2024年2月25日，星期天通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的组分洗脱下来：a)如果亲合复合物的亲合力不强b)当配基与被分离组分的亲合力较强c)非常紧密地结合在固定相配基上的物质洗脱第59页,共69页，2024年2月25日，星期天配基与待分离物质的亲合作用的强弱可以用亲合复合物的结合常数来表示。这一常数不宜太低，也不宜太高。太低专一性太差，太高则洗脱困难。R：结合在亲合色谱固定相上的生物分子的活力K：复合物的离解常数L：固定化配基的浓度第60页,共69页，2024年2月25日，星期天二、亲合色谱的固定相亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基，就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基相对应的物质。第61页,共69页，2024年2月25日，星期天1、有机高分子类：多孔的硬质凝胶——交联聚苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性等树脂。优点①具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性，广泛的PH值的适应性②对于生物大分子样品都有较好的相溶性。③填料容易合成第62页,共69页，2024年2月25日，星期天2、无机基质①多孔硅胶②可控孔径玻璃第63页