《猕猴桃无病毒种苗生产技术规程》征求意见稿编制说明

《猕猴桃无病毒种苗生产技术规程》（征求意见稿）其中我国的栽培规模最大，栽培面积29.1万公顷，产量300.6万吨，分别占世界猕猴然而，近年来随着猕猴桃栽培面积的不断扩大，猕猴桃病毒病的扩散和蔓延也成为威胁猕猴桃安全生产的隐患之一。目前，共鉴定出24种可侵染猕猴桃的病毒，包括严重时会引起树干枯死、树皮开裂、果实大小不均匀等症状，极大影响产量和质量，造成严重经济损失。有研究指出，猕猴桃病毒病在陕西不同地区，不同猕猴桃种及品植物病毒是专性细胞内寄生物，只寄生在寄主的活细胞内，可通过营养繁殖世代传播，还可通过昆虫媒介从受病毒感染的植物传播到健康的植物，长期以来一直是农业生产可持续发展的制约因素。猕猴桃常通过嫁接繁殖，因此导致了病毒在猕猴桃植株上的积累和传播。虽然化学药品在控制病毒病方面有潜在的应用，但培育无病毒植物才是有效控制它们的一种农业策略。目前，世界各地广泛种植无病毒植物，以控制许多重要经济作物的病毒性疾病，如块茎作物、草本观赏植物。从其他国家进口新品种及国家或地区之间交换育种材料也都需要无病毒材料。此外，植物种质资源保存也强调使用无病毒植物。因此，建立猕猴桃病毒脱除技术体系，制定“猕猴桃脱毒种苗生产技术规程”具有重要的生产及经济意义，为后续猕猴桃脱毒苗的生产提供理论基技术路线、主要研究方法，标准的具体格式，确定了标准的总体框架和制定原则，明确了标准制定的具体工作计划和进度。起草小组通过多年自身试验研究资料的整理，结合对其他同行业无病毒种苗生产的数据资料的研究等方法，在总结起草单位多年来猕猴桃无病毒种苗培育和实践的基础上，全面开展标准由西北农林科技大学主导，杨凌梦绿生态农男女女女男男包括标准编制所遵循的原则，以及标准结构、要素、技术要求、关键指标的确定依据和主要内容；地方标准修订项目还应当本标准遵循适用性、先进性、统一性和协调性的原则，始终将经济效益、生态效名称、适用范围、术语和定义、要求等要素。主要内容包括标准的适用范围、术语和定义、脱毒原理、病毒检测与脱除、无病毒母本园的建立、无病毒苗木的繁育、无病本标准实施验证工作开展了大量的试验，尤其是对于结束时（42d试管苗生长变化明显，尤其在物病毒感染的症状均表现在叶片上，且后者比前者症状更明显，植株的增殖受到了明图3-1利巴韦林化疗后14、28和42天的离体大籽猕猴桃植株的生长情况Fig.3-1GrowthofinvitroActinidiamacrospermaplantsafterchemotherapytreatmentswithribavirinfor14,28,and42days对照:离体大籽猕猴桃植株在标准生长室内培养;R25、R50、R75和R100:离体大籽猕猴桃植株在生长室中培养在添加利巴韦林的增殖培养基上，浓度分别为25、50、75、100mg/L。CK：InvitroActinidiamacrospermaplantswereculturedinastandardgrowthroom;R2,R50andR75invitroActinidiamacrospermaplantswereculturedinagrowthroomonMSmediumsupplementedwithribavirinat25,50and75mg/L,respectively3.2基于化学疗法的脱毒处理对带毒试管将带毒大籽试管苗外施0、25、50、75mg/L利巴韦林在增殖培养基上培养6周后，测量不同浓度利巴韦林处理时大籽猕猴桃试管苗营养生长和增殖。营养生长统计结果如表3-1所示，在使用4个浓度利巴韦林对植株进行脱毒处理时，植株在节间的15.74mm，高于25、75mg/L处理下的植株表现但不显著；节间长达到了最长的4.38mm，显著高于对照组和使用75mg/L的利巴韦林处理植株；节间数高于其他处理但不显著；鲜重、干重及干重均显著高于对照处理；仅有叶宽叶长出现了低于其他处不同脱毒处理对“大籽”猕猴桃试管苗增殖结果的影响统计结果如图3-2所示，使用50mg/L的利巴韦林处理对植株的增殖数产生了显著影响，高浓度利巴韦林利巴韦林处理下大籽猕猴桃植株综合生长指标最好，与处理6周时植株的生长情况一然后再经过4周的热处理后均可以成活。对该处理下试管苗营养生长和增殖状况进行利巴韦林处理后的试管苗植株高度达到了24.27、25.34mm，显著高于对照组植株的但不显著。节间数、叶宽、鲜重、干重在不同浓度利巴韦林处理下和对照组无显著差异，但从增殖系数来看（图3-250mg/L浓度利巴韦林处理后的植株增殖系数最大为图3-2不同脱毒处理对“大籽”猕猴桃试管苗增殖系数的影响Fig.3-2EffectsofdifferentdetoxificationtreatmentcombinationsonproliferationcoefficientofActinidiamacrospermatubeseedlings注：T代表热处理（38℃光下16h，32℃黑暗8hR25、R50和R75代表利巴韦林浓度25、50和75mg/L；‘-’表示无再生，下同。Note：Trepresentsheattreatment(16hat38°Clight,8hat32°Cdark);R25,R50andR75representribavirin,concentrationsof25,50and75mg/L,‘-’representsnoregeneration,thesameasbelow.表3-1不同浓度利巴韦林处理和不同浓度利巴韦林处理结合热处理对大籽试管苗营养生长的影响Table3-1EffectsofdifferentconcentrationsofribavirintreatmentanddifferentconcentrationsofribavirincombinedwithheattreatmentonthevegetativegrowthofActinidiamacrospermatubeseedlings处理Treatment株高/毫米Plantheight/mm节间数Nodenumber节间长/毫米Nodelength/mm茎粗/毫米Stemdiameter/mm鲜重/克Freshweight/g干重/克Dryweight/g叶长/毫米Leaflength/mm叶宽/毫米Leafwidth/mm叶片数NumberofbladesCK15.74±0.84b3.6±0.16a2.66±0.33b0.99±0.05b0.35±0.04c0.05±0.00b17.71±1.54a14.40±1.38bR2522.70±1.88a3.58±0.38ab1.08±0.03ab0.48±0.03ab0.05±0.00ab20.60±0.82a13.80±0.85a15.17±1.16bR5023.26±1.61a4.1±0.23a4.38±0.46a1.25±0.08a0.52±0.03a0.06±0.00a19.03±0.60a13.29±0.59a20.40±1.90aR7520.28±0.83ab3.6±0.16a3.08±0.18b0.39±0.03bc0.05±0.00ab20.45±0.96a13.61±1.20a17.30±1.02abT13.42±1.2c3.5±0.17b2.95±0.43b0.87±0.05b0.36±0.06a0.05±0.01a18.97±1.71b11.80±1.12aT+R2524.27±2.3ab4.54±0.22a6.84±0.65a0.33±0.06a0.06±0.00a27.14±1.66a16.66±1.03a12.85±0.85aT+R5025.34±3.25a4.4±0.16a5.35±0.65a0.41±0.06a0.06±0.01a26.37±1.30a15.32±0.68a13.70±1.54aT+R7517.02±0.96bc3.7±0.21b2.85±0.29b1.06±0.06a0.31±0.06a0.05±0.01a22.85±0.89ab12.30±0.99a注：增殖培养6周后统计结果。数据为平均数±标准误，同列中不同字母表示经Tukey’stest检验存在P<0.05的差异显著性。Note：Resultswererecordedafter6weeksofshootproliferation.Datawerepresentedasmeans±SEanddifferentlettersaresignificantlydifferentatP<0.05analyzedbyTukey’stest.用不同浓度利巴韦林对猕猴桃试管苗进行处理后，植株中AcVA、AcVB和毒来说，使用75mg/L浓度利巴韦林处理下植株病毒含量与使用25mg/L浓度利巴韦林处理时无显著差异，但显著高于使用50mg/L利巴韦林处理，但三者对图3-3大籽猕猴桃试管苗在不同浓度利巴韦林处理下的病毒含量Fig.3-3ViruscontentofActinidiamacrospermatest-tubeplantletstreatedwithdifferentconcentrationsofribavirin显示不同浓度利巴韦林结合热处理后对AcVA病毒含量的影响存在显著差异，Ct值的范围在28.90-31.50，其中对照组病毒含量最高为28.90，热处理结合9热处理结合25、50、75mg/L利巴韦林处理后的病毒含量显著低于对照组；热图3-4不同浓度利巴韦林处理结合热处理对大籽猕猴桃试管苗病毒含量的影响Fig.3-4EffectsofribavirintreatmentatdifferentconcentrationsontheviruslevelsofActinidiamacrospermatubeseedlings注：以上试验数据用平均值±标准误来表示。不同的字母使用Duncar新复极差法在P＜0.05上进行分析的显著性差异。Note：theabovetestdataareexpressedbymeansofaverageplusorminusstandarderror.SignificanceanalysiswasconductedusingDuncar'snewcomplexrangemethodtocomparethesignificanceatP<0.05.表3-5大籽猕猴桃在不同脱毒方法组合处理下茎尖的成活率与再生率Table3-5SurvivalrateandregenerationrateofshoottipsofActinidiamacrospermatreatedwithdifferentdetoxificationmethods时长/天-T20.4±1.91f--切取0.3-0.5mm大小的大籽猕猴桃试管苗茎尖并结合28天的热处理使用50mg/L的利巴韦林处理时，大籽猕猴桃茎尖的再生率同样达到最高，为对大籽猕猴桃进行不同浓度利巴韦林结合超低温疗法脱毒试验中，在含有对照的53.4%，随着利巴韦林浓度的加大，75mg/L处理时的成活率出现了显著茎尖的成活率与再生率均显著低于仅使用利巴韦林处理结合超低温疗法中植株水平，对照组植株的成活率和再生率最高分别为52%和30%。随着利巴韦林浓度的升高，成活率和再生率逐渐变低，50mg/L的利巴韦林处理下茎尖成活率只表3-6化学疗法或化疗结合热处理对大籽猕猴桃带毒试管苗茎尖培养脱除病毒的影响Table3-6EffectsofchemotherapyorthermotherapycombinedwithchemotherapyonviruseradicationofshoottipcultureinvitroofActinidiamacrospermaTreatment处理茎尖培养的脱毒率（%）ViruseradicationbyShoottipculture（%）AcVAAcVBAcCRaVTotalCK70(21/30)83.3(25/30)60(18/30)60(18/30)R2593.3(28/30)96.6(29/30)93.3(28/30)83.3(25/30)R5096.7(29/30)100(30/30)96.7(29/30)93.3(28/30)R75100(30/30)100(30/30)96.7(29/30)96.7(29/30)T86.7(26/30)93.3(28/30)66.7(20/30)66.7(20/30)T+R2596.7(29/30)100(30/30)100(30/30)96.7(29/30)T+R50100(30/30)100(30/30)100(30/30)100(30/30)T+R75100(30/30)100(30/30)100(30/30)100(30/30)表3-7化学疗法或化疗结合热处理对大籽猕猴桃带毒试管苗超低温冷冻后脱除病毒影响Table3-7EffectsofchemotherapyorthermotherapycombinedwithchemotherapyonviruseradicationofcryotherapyinvitroofActinidiamacrospermaTreatment处理超低温冷冻后的脱毒率（%）ViruseradicationbyCryotherapy（%）AcVAAcVBAcCRaVTotalCK69.2(9/13)30.7(4/13)30.7(4/13)R2553.3(8/15)53.3(8/15)R50100(4/4)100(4/4)75(3/4)75(3/4)R75----T100(7/7)100(7/7)100(7/7)100(7/7)T+R25100(2/2)100(2/2)100(2/2)100(2/2)T+R50----T+R75----注:括号中的数字代表RT-PCR病毒检测的阴性样本数/检测样本总数，“T”代表“Thermotherapy”。“-”为没有获得再生苗。Note:Thenumbersinbracketsrepresentthenumberofnegativesamples/totalnumberofsamplestestedforRT-PCRvirus,with"T"representing"Thermotherapy"."-"indicatesnoregeneratedseedlings.对不同浓度利巴韦林结合茎尖培养和不同浓度利巴韦林结合热疗和茎尖培韦林明显提升了茎尖培养脱毒率，且利巴韦林浓度越高脱毒率越高，75mg/L利韦林处理下对AcVB和AcCRaV的脱除率均达到了100%,只有2株再生苗对不同浓度利巴韦林结合超低温冷冻培养和不同浓度利巴韦林结合热处理冻培养下，植株成活率和再生率效果差，50mg/L利巴韦林处理只得到了4株再当利巴韦林浓度为25mg/L时，分别得到了组合进行脱毒，得到的茎尖脱毒率较低，但茎尖成活率高于表3-8猕猴桃病毒超低温脱除方法比较Treatment茎尖大小(mm)茎再生率(%)脱除率AcVA(%)脱除