医学生物实验技术指南

《细胞生物技术试验指南》

刁勇徐瑞安主编

第一章细胞与生物技术基础

第一节细胞生物学

1.生物细胞学研究，应采取分析与综合相结合的方法，从细胞整体、亚显微结

构以及分子三个不同层次将细胞的结构和功能有机结合并进行讨论。

2.细胞生物学研究的重点内容：

⑴生物膜结构与功能研究：一系列生命活动。

⑵细胞骨架体系研究

细胞骨架是真核细胞细胞器，包括微丝、微管和中间纤维。在真核细胞

的核内，除染色体、核仁、核膜外，还有一个以蛋白质为主的网架结构

体系，称为核骨架。核骨架主要包括核基质、核纤层和核孔复合体，其

在染色体的构建及基因表达中具有重要作用。

(3)真核细胞的细胞核、染色体和基因表达的研究

细胞核与染色体的研究素为经典细胞学重点,现代细胞生物学核心课题之

一就是研究染色体结构动态变化与基因表达及其调控的关系。

(4)细胞增值与调控

〜切动植物的生长与发育都是通过细胞增殖和分化来实现的。研究细胞

的增殖的基本规律及其调控机制不仅是控制生物生长与发育的基础，而

且是研究癌变的发生及逆转的重要途径。

⑸细胞的分化及调控

细胞分化是指在个体发育中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐

暂形态、结构和功能方面形成稳定性差异，从而产生不同类型的细胞类

群的过程。分化是个体产生稳定性组织的过程。是细胞内基因选择性表

达特异功能性蛋白的过程。

(6)细胞衰老与凋亡

细胞衰老与机体的衰老是不同的概念。动物的二倍体细胞在体外分裂与

传代的次数是有限的。细胞凋亡是…系列基因控制并受复杂信号调节的

细胞自然死亡的现象。

(7)细胞起源与进化：推理性为主。

(8)细胞工程

细胞工程是细胞生物学与遗传学的交叉领域，这种改造技术是生物工程

技术的重要组成部分。动植物体细胞杂交试验一直是细胞工程最活跃的

领域。

⑼细胞信号转导与通讯

细胞与细胞之间相互反应与相互作用为细胞通讯。细胞将周围环境中信

号转化为某种功能上的变化，从而调节代谢变化。

(10)细胞结构体系装配

在亚细胞水平上，可将细胞结构大致归纳为三个基本体系：蛋白质和核

酸构成的遗传信息结构体系(染色体、核糖体、核仁)，由蛋白质与脂质

构成的细胞膜(细胞膜、核膜与各种细胞器膜)，蛋白质与蛋白质构成的

细胞骨架结构体系。装配、去装配、重装配与重建过程。

(11)干细胞及其应用

干细胞是体内最原始的细胞，它具有较强的再生能力，在一定的条件下

可分化扩增出格雷细胞。由于干细胞数量较少，所以分离、保存并在体

外大量培养使之成长为各种组织和器官便成为干细胞研究的主要课题。

目前取得较大进展的是造血干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞。

3.细胞生物学技术

⑴细胞形态观察技术：

1)光学显微镜技术：

①普通光学显微镜技术；

②荧光显微镜技术-免疫荧光技术和荧光素直接标记技术；

③激光扫描共聚焦显微镜技术：在荧光显微镜成像技术基础上，以

单色激光为光源，是样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从

而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。

④相差和微分干涉显微镜技术-把光程差变成振幅差，提高各种结构

的对比度，使各种结构变的清晰可见。

⑤暗视野显微镜技术-原理是给样品照明的光不直接穿过物镜，而是

由样品上反射或者折射的光进入物镜。因此漆黑的视野中，反差增大使

样品更清楚。

2）电子显微镜技术

观察细胞内部结构。电竞不能直接观察自然状态下的生物标本，必须先通

过各种技术将生物标本制成合适的电镜观察样品。

3）扫描隧道显微镜技术

扫描隧道显微镜是用来显示晶体表面原子布阵，其可以直接观察DNA、RNA

和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等的结构。

⑵细胞化学技术

细胞化学技术，是保持细胞结构条件下，通过一定的化学染色手段将细

胞内或细胞膜上的某种化学成分显示出来的一种技术。

1）酶细胞化学技术：酶细胞化学技术既保持细胞在结构完整性，又将酶

在细胞上不同的结构上进行定位，并保持活性。该技术是利用酶的

特异性细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱•种技

术，使细胞结构与功能的关系尽可能地在符合在自然状态下得到显示。

2）免疫细胞化学技术：又称免疫组织化学，利用免疫学抗体与抗原特异

性结合的原理，通过组织化学技术对细胞特定的抗原或抗体进行定位

或定量的检测，经过组织化学呈色后，用显微镜、荧光显微镜和电子

显微镜观察。

3）反射自显影技术：放射性核素是一种不稳定的元素，能连续不断地进

行蜕变，在蜕变的过程中，伴随着粒子和射线的辐射，利用放射性核

素所发射的带电粒子，使得感光材料大声作用，从而显示出标本中放

射性物质所在的位置和数量，此种方法为反射性自显影。

（3）细胞组分分析方法

对细胞和细胞内的组分进行深入了解，者必须对这些成分进行生物化学

的分析。

1）流式细胞技术：流式细胞技术是利用流式细胞仪分选或检测细胞及其

组分的物理或化学特性的技术。流式细胞一可以定量测定某一细胞中

的DNA、RNA或某一特异蛋白质的含量，以及细胞群体中上述成分及

含量成分不同的细胞的数量。

2）显微分光光度技术：显微分光光度技术测量是利用细胞内某些物质对

特异性光谱吸收的原理，用来测定这些物质如核酸与蛋白质等在每一

细胞内的含量的一种技术。其中显微荧光光度技术是通过测试固定组

织内的荧光反应物来对生物标本进行定量分析。

3）生物质谱：生物质谱是根据生物分子治疗和所载电荷数的不同，在磁

场中会产生不同的轨迹，从而根据质荷比而相互分离的技术。其中有

适合蛋白质研究的软电离方式，ESI（电喷雾电离）和MALDL（基质

辅助激光吸附电离）。生物质谱的强大功能在于能够鉴定蛋白质复合

物的组成成分。

4）超速离心技术：根据物质的沉降系数、质量、密度等不同，应用强

大的离心力使物质分离、浓缩和提纯的方法称为离心。离心机的转速

在2000r/min以上的离心机称为超速离心机。通过不断增加相对离心

力，使一个非均匀混合液内的不同大小。形状的颗粒分布沉淀，则称

为差速离心。离心操作如果是在一种连续密度梯度介质中进行，者称

为密度梯度离心。

⑷细胞工程技术：细胞工程是在细胞水平上的生物工程。细胞工程所使用

的技术主要是细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。

细胞工程与基因工程结合，前景尤为广阔。

⑸细胞分子生物学技术。

第二节细胞分子生物学

1.细胞分子生物技术

⑴原位杂交技术

对已知序列的DNA或RNA片段标记上可识别或可检测的标记物，再与细

胞、组织或染色体中的核酸进行分子杂交，成为细胞、组织或染色体原

位杂交。

⑵聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术（PCR）技术又称体外基因扩增技术。

⑶转基因技术

转基因技术是根据人们的意愿对不同生物的遗传基因进行切割、拼接或

重新结合，再应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源基因转移到

受体菌或细胞内，并使之在细胞内实现转入基因的扩增或表达。

（4）基因敲除和敲入

应用基因的同源重组（基因打靶），即用无功能的外源基因转入细胞与基

因组中的同源序列进行重组，把具有同源序列的有功能的基因置换出来,

造成功能基因的缺失或失活的技术成为基因敲除。相反，将外源有功能

的基因（基因组中原先不存在或已失活的基因）转入细胞中，与基因组

中的同源序列进行重组，并且在细胞内获得表达的技术称基因敲入。

⑸反义技术

能与有功能的RNA（主要是mRNA）互补结合，并干扰其功能的RNA或

DNA,称反义核酸。利用反义核酸影响相对应的mRNA的转录、翻译，

从而改变细胞生物学功能的技术称为反义技术。反义核酸有反义RNA和

反义DNAo

第三节细胞工程

1.基本概念

⑴根据研究对象可以将细胞工程分为微生物细胞工程、植物细胞工程、动

物细胞工程。

⑵根据研究技术而言，主要包括细胞培养、组织培养、细胞融合、细胞拆

合、染色体操作、胚胎移植、细胞核移植等。

2.细胞工程技术

⑴植物细胞工程技术

植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展起来的。它主要由两部分

组成，其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个

步骤。另一个则是下游工程，是将已转化的细胞应用到实践中去，以生

产生物产品的过程。

⑵动物细胞工程技术

动物细胞工程，主要从细胞生物学和分子生物学的层次，根据人类的需

要，一方面深入探索和改造生物的遗传种性，另一方面是应用工程技术

的手段，大量培养细胞和动物本身，以期收获细胞或其代谢产物以及可

利用的动物。

1）动物细胞培养

2）动物细胞融合

细胞融合是指用人工方法使两种或两种以上的体细胞融合并形成…

个细胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞的方法。诱导细胞融合

的方法有生物方法（病毒）、化学方法（PEG）、物理方法（点击和激

光）等。

3）单克隆抗体技术

第二章细胞显微观测技术

第一节细胞显微技术

1.双荧光染色观察活细胞的细胞核和线粒体

【实验原理】

一般生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透

性，染料才能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料，Hochest33342

和若丹明123都是活体染料，HO33342能与细胞中的DNA进行特异性结合，而

罗丹明123能与线粒体进行特异性结合，采用两种荧光染料的混合液可对一个活

细胞的细胞核和线粒体同时染色。

【实验用品】

①材料：口腔黏膜处上皮细胞；

②试剂：荧光染料HO33342,罗丹明123,指甲油。

③设备与工具：荧光显微镜，水浴锅，载玻片，盖玻片，镜子，消毒牙签。

【试剂配制】

双荧光染液：含0.25ug/mLHO33342和罗丹明123lug/mL的PBS液。

【实验操作】

①用牙签在自己的口腔黏膜处刮去上皮细胞涂于干净的载玻片上。

②滴一滴双色荧光染液与细胞表面上。

③加上盖玻片，防止气泡，用指甲油把盖玻片的边缘封闭好。

④用落射式荧光显微镜观察。

【注意事项】

①每种荧光都有最适合的pH值，且此时荧光最强，当染料的pH值改变时，不

仅荧光减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测要在一定pH缓冲液中进行。

②荧光通常在20℃以下比较稳定，荧光会随着温度的升高出现温度淬灭。

③在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品的荧光很快衰竭，造成观察和照

相困难。为此，最好能用能量较小的长波长进行观察,照相时再适当增强激发光。

④一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一也能使标本着色。在

一定的限度内，荧光的强度可能随荧光素浓度的增加而增强，但超过限度，荧光

强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使用自身淬灭所致。

【实验结果与分析】

先用高倍镜观察细胞核(采用紫外线激发滤片/双色束分离器/内装阻断滤片

的组合插块置于光路)，可见核发蓝色荧光。再换油镜观察线粒体(换紫光或蓝

光的组合插块)，在细胞核附近可见有一些发绿光的圆形和短杆状颗粒分布，即

为线粒体。

2.碘化丙咤PI的染色浓度为5Ug/mL,PBS配制。

3.Annexin-V检测细胞早期凋亡

Annexin-V试剂盒是检测凋亡早期细胞膜损伤的新方法。在凋亡的早期阶段，变

化主要发生在细胞表面。虽然细胞膜的完整性尚还维持，但膜磷脂已失去平衡。

此时位于细胞膜上的磷脂酰丝胺酸(phosphatidylserine,PS)会从细胞膜的内侧

翻到外侧，露于细胞外环境中。而Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，

与磷脂具有高度亲和力，它可与转移到膜外的PS结合，从而在，这些早期凋亡

细胞还未出现形态学改变及DNA降解前，即可以通过Annexin-V荧光染料染色而

检测到。细胞凋亡早期，可见到仅细胞被染成绿色，在凋亡中期，Annexin-V荧

光染料进一步与胞浆内的PS结合，可见细胞膜及细胞浆被染成绿色。Annexin-V

一般要与碘化丙咤(PI)结合使用，PI这种核酸染料不能透过完整的细胞膜，但

对于凋亡晚期的细胞和死细胞，PI能够透膜而使其染红。因而，Annexin-V与PI

配合使用，能将凋亡与死细胞鉴别开来，并且可以初步确定细胞凋亡的进程。

【实验用品】

⑴材料悬浮细胞，贴壁细胞

(2)试剂Annexin-V试剂盒,50口g/ml碘化丙喔，结合缓冲液(lOmmol/LHEPES,

140mmol/LNaCI,5mmol/LCaCI2,pH7.4)。

⑶设备与工具激光扫描聚焦显微镜。

【实验操作】

⑴贴壁细胞样品的制备

1)取培养于盖玻片的细胞，加入1ml冰冷的PBS轻轻振荡漂洗。重复2

次。

2)贴壁轻轻加入200uL结合缓冲液。

3)介入10口LAnnexin-V-FITC和5HLpI,轻轻混匀,避光室温反应15min

或4℃反应3min.

4)加入300“L结合缓冲液，进行激光扫描共聚显微镜检测。

⑵共聚焦显微检测根据细胞大小、密度选择物镜(通常20倍或40倍)。Z

轴扫描步距200~1000nm。扫描方式为XYZ。采用三通道检测，第一通道

激发光为488nm,检测发射光波长为530nm±15nm,伪彩色采用绿色；

第二通道激发光为488nm或567nm,检测发射光波长大于590nm,伪彩色

采用红色；第三通道采集透射光图像，伪彩色采用黑-白色。

【实验结果与分析】

⑴单染绿色的细胞为凋亡早期的细胞和中期细胞。凋亡的早期，仅细胞膜

被染成绿色。凋亡中期以后,Annexin-V-FITC会进一步与胞浆内的PS结合，

可见到胞膜及胞浆被染成绿色。每个细胞上的绿色斑点大小代表细胞膜

外翻的程度，斑点越大，说明PS外翻约严重。

⑵绿、红双染或红色单染为凋亡晚期或死亡的细胞。

⑶绿、红均未染色，只有光镜图像为细胞为未凋亡的正常细胞。

补充：

1.激光扫描共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscopy,LSCM)是在荧光

显微镜成像的基础上加装扫描装置，使用紫外线或可见光激发荧光探针，利

用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以

及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的

变化。

(1)LSCM的主要组成部分及工作原理

激光扫描共聚焦显微镜组成除光学显微镜部分外主要由激光光源、扫描

装置、检测器、计算机系统(包括数据采集、处理、转换、应用软件)、图像

输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。点光源照射样品产生的激光发光斑

被探测器以共轲形式接收于焦平面，计算机以像点的方式将被探测点显示在

计算机屏幕上。为产生一幅完整的图像，可通过计算机控制的步进电动机带

动显微镜移动，以实现在同-焦平面上的逐点扫描。同样，也可以通过沿Z

轴方向逐渐改变焦平面来完成对样品不同层面的扫描。亦即可对细胞或组织

厚片进行类似CT断层扫描无损伤的光学切片，连续光学切片经过计算机三维

重建的处理，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构。

激光扫描共聚焦显微镜在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动

态变化过程以及组织和细胞的连续光学切片和三维重建等方面。

与光学显微镜相比，激光扫描共聚焦显微镜具有以下特点：

1)LSCM的图像是以电信号的形式记录下来的，所以可以采取各种模拟

的和数字的电子技术进行图像处理；

2)LSCM利用共聚焦系统有效地排除了焦点以外的光信号干扰，提高了

分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使得无损伤光学切片技术

成为可能，达到了三维空间定位；

3)由于LSCM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察

活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径；

4)LSCM除有成像功能外，还具有图像处理功能和细胞生物学功能，前

者包括光学切片、三维图像重建、细胞物理和生物学测定、荧光定

量和定位分析以及离子的实时定量测定；后者包括黏附细胞的分选,

家光细胞显微外科及光陷阱技术、荧光漂白后恢复技术等。

4.细胞蛋白质总量分析

异硫氟酸荧光素(FITC)是检测细胞蛋白总量常用的荧光探针，它是酸性

染料，能以共价键的方式结合到蛋白质带正电荷基团上，以蓝色激发光可以发出

明亮的绿色继发荧光，绿色继发荧光的强度与细胞蛋白质的含量呈正相关。

检测细胞蛋白的总量可以检测一个细胞群体的生长和代谢状态，也能区别

蛋白含量不同的样品。

【实验用品】

①材料：单细胞悬液(lX10A6j/mL),12mmX75mm的Falon管。

②试剂：FITC染色液，无水乙醇，PBS(pH7.4),70%乙醇(破膜剂)。

③设备与工具混合震荡器，流式细胞仪，孵箱，离心机。

【试剂配制】

①FITC染色液取20mg异硫氟酸荧光素，加20mL无水乙醇，使FITC充分溶解，

即为染色液的原液，保存于4℃冰箱待用。

②FITC工作液将FITC染色液用pH7.4的PBS液稀释成50口g/mL浓度的工作液。

【实验操作】

①细胞悬液中加70%的酒精，破膜lOmin,以800r/min离心，弃破膜剂。

②PBS洗涤细胞，以800r/min收集细胞。

③取FITC工作2mL加入样品中，混匀，置4℃冰箱中反应30min。

(4)以1500rpm离心，弃工作液。

⑤加0.5mLPBS,混匀，上机检测。

第三章细胞检测技术

第一节流式细胞仪检测技术

流式细胞术(flowcytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生

物粒子进行定量分析和分选的检测手段。它可以高速分析上万个细胞，并能同时

从一个细胞中测得多个参数，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

流式细胞术是在流液束、照明光轴、检验系统光轴三者相互正交的流式细胞

计的基础上，用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存

在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚的显示出细胞周期的各个时相。

流式细胞术(Flowcytometry,FCM)用于免疫组化中的关键是对细胞进行免疫

荧光染色。

1.流式细胞仪的工作原理和基本操作

（1）仪器构造

流式细胞仪主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和

光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。

1）流动室和液流系统

流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，由光学玻璃、石英等材料制作，

是液流系统的心脏。样品管用来储放样品，单个细胞悬液在液流压力作

用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后

从喷嘴射出。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。

2）激光源和光学系统

经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检

测。常用的光源有弧光灯和激光，激光器以僦离子激光器为主。

为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径

应和细胞直径相近。因此需要将激光光束经透镜会聚。

为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光信号的信噪比，在

光路中还使用了多种滤片。带阻或带通的滤片是有选择性地使某一波长

区段的光线滤除或通过。

在免疫分析中常压要同时探测两种以上的波长的荧光信号，这是要

采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。

二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一

特定波长的光线反射。

3）光电管和检测系统

经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器变

成电信号而进行测量的。

4）计算机和分析系统

经放大后的电信号被送往计算机分析器，进行数据的储存、处理和分析，

最后给出结果。

⑵工作原理

将待测标本制备成单细胞悬液后荧光染色，压入充满鞘液的流动室。当鞘液

压力与样品流压力的差异达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐

个经过激光聚焦区。

标上特异性荧光染料的细胞在通过激光检测区时发出特定波长的荧光，通过

一定波长选择通透性的滤色片，可将不同波长的散射光、荧光信号区分开，并送

到不同的光电倍增管中，经过一系列的信号转换、放大，数字化处理，就可以用

计算机直观地统计染上各种荧光染料的细胞百分率。

选择不同的荧光染料，就可以利用FCM同时测定一个细胞上多种不同的特

征，即参数测量；

如果对具有某种特征的细胞有兴趣，还可以利用流式细胞仪的分选功能将其

分选出来，以便进一步培养、研究，即样品分选。

1）参数测量原理

I.流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非

荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和

喷出喷孔的流液束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受

到激光照射会向立体角为2Ji的整个空间散射光线，散射光的波长和入摄

光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜

和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、

折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散

射，因此可利用不同的散射信号对不经染色的活细胞进行分析和分选。

经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号不同

于活细胞。散射光信号不仅与作为散射中心的细胞参数相关，还跟散射

角及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

II.在流式细胞的检测技术中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前

向角（即0°角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC）,又称90°角散射。

这里所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管

轴向方向之间大致所成的角度。-一般说来，前向角散射光的强度与细胞

的大小有关，对同种细胞群体随着俄细胞截面积的增大而增大；对球形

活细胞，经实验表明，在小立体角范围内基本上和截面积大小呈线性关

系；对于形状复杂具有取向性的细胞，则可能差异很大，尤其需要注意。

侧向散射光虽然也能与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、

核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反应。

III.在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧

光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色的细胞。光散射测

量最有效的用途是从非均一的人群中鉴别出某些亚群。

IV.荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧

光分子经光照射后发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的

荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不

同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的

分辨和测量。在免疫细胞化学等的测量中，对于结合水平不高的荧光抗

体来说，提高信躁比是关键。一般说来，细胞成份中能够产生自发荧光

的分子(例如核黄素、细胞色素等)的含量越高，自发荧光越强；培养

细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞

的比例越高，自发荧光越强。

2)样品的分选原理

流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴

射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路

判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携

带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其他液体当作作废液抽

吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

3)数据的显示与分析

I.数据显示

①FCM的数据显示方式包括单参数直方图(histogram)>二维点图

(dotplot)>二维等高图(contour)、假三维图(pseudo3D)和

列表模式(listmode)等。

②直方图是一维数据用得最多的图形显示形式，既可以用于定性分

析，又可以用于定量分析，形同一•般X-Y平面扫描图仪给出的曲

线。

③二维点图是能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横

坐标和纵坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个

点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。可以由二维点图得到两

个一•维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大

于两个i维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同

二维坐标，在图上只表示一个点，这样对细胞点密集的地方就难

以显示它的精细结构。

④二维高等图类似于地图上的等高线表示法。它是克服二维点图的

不足而设置的显示方法。等高图中每一条连续曲线上具有相同的

细胞相对或绝对数，即“等高二曲线的层次越高所代表的细胞数

愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密

集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化越平衡。

⑤假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现

方法。它把原二维图中的隐坐标——细胞数同时显现，但参数维

图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷

地”的结构和细节，这无疑有助于对数据进行分析。

II.数据分析

数据分析的方法可以分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的

生物学系统能够用某种数学模型技术时多使用参数方法。数学模型可

以是一个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数

据。而非参数分析方法对测量得到的分布形状不需要作任何假设，即

采用无设定参数分析法。

2.流式细胞术样品制备技术

FCM进行各种参数分析必须以单细胞为基础，根据各种组织成分的特点

应选择不同的细胞分散方法，以期达到单细胞产量高、损伤少的目的。

实验证明，酶法与化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学

成分有不良影响。机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低。化学处

理方法导致活细胞存活率较低，细胞产量低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳

定。化学试剂可单独使用，也可与其他方法结合使用。

要根据实验目的选择合适的单细胞悬液制备方法，才能还获得理想的样

本和好的FCM检测结果。

⑴酶消化法

【原理与应用】

酶消化法是将组织和培养细胞分散成为单细胞的主要方法之一。其原理

主要有3个方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解

组织间的黏多糖等物质；③可以水解组织间的紧密连接装置的蛋白物质。

常用的酶试剂有：

蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和中性蛋白酶等，都

能解离组织中的细胞；

胰蛋白酶能水解酯键和肽键；

胶原酶能降解儿种分子类型的胶原；

溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖背键；

弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白纤维。

故可根据分散组织的类型来确定使用的酶类。

【实验操作】

①将适合于酶消化的组织置于离心管中。

②将选好的2ml酶溶液加入盛有被消化组织的试管中。

③一般消化20~30min（恒温37c或室温），消化期间要间断振荡或吹

打。

④终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，出去细胞团块，

以低速离心除去细胞碎片。

⑤将制备好的单细胞悬液保存备用。

【注意事项】

①酶需要溶解于适当的溶液中，而且这些溶液不至于造成酶效价降低。

②要注意酶的使用浓度和消化时间。

③要注意酶活性的pH,如胃蛋白酶在碱性环境中会失去活性，而胰蛋

白酶在中性环境中活性不佳。

④要随时注意酶活性的其他因素，如酶的生产批号等。

⑵机械法

机械法分剪碎法、网搓法和研磨法。机械法易造成细胞碎片或细胞团块,

所以常需与其他方法配合使用。

【实验操作】

I.剪碎法

①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水。

②用剪刀将组织剪至匀浆状。

③加入10ml生理盐水。

④用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中。

⑤以1000r/min离心沉淀，4~5min,再用生理盐水洗3次，每次以低速

(500~800r/min)短时离心沉淀去细胞碎片。

⑥以300目尼龙网滤去细胞团块。

⑦细胞用固定液固定或低温保存备用。

II.研磨法

①先将组织剪成1~2mm3大小的组织块。

②放入组织研磨器中加入1~2ml生理盐水。

③转动研磨棒，研至匀浆。

④加入10ml生理盐水，冲洗研磨器。

⑤收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，以500~800r/min离心沉淀，

l-2min,再以生理盐水洗3次，离心沉淀。

⑥固定或低温保存细胞悬液，备用。

⑶化学处理法

化学处理法是将组织或细胞间起连接作用的钙、镁离子置换出来，从而

使细胞分散开来。

【试剂配制】

①0.2%EDTA溶液称EDTA0.2g,力H入Hank's液100ml,高压灭菌。置于0~4℃

保存。

②胰酶-EDTA溶液胰酶0.25g,力口入PBS(pH7.0)200ml。EDTA0.2g加PBS

(pH7.0)100mlo各取40ml混合，分装，置冰箱保存，用时过滤。

【实验操作】

I.组织

①将组织切成包薄片，置入试管中。

②首先加入EDTA液5mI,室温下放置0.5h,离心弃上清液。

③再加入胰酶-EDTA液5mL在37℃恒温水浴振荡30min。

④用300目尼龙网过滤，以1000r/min离心沉淀，5min。再以生理盐水洗

2~3次。

⑤细胞固定或低温保存备用。

II.培养细胞

①贴壁培养细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化3~7min。细胞变圆有脱落趋势

时，弃去胰蛋白酶溶液。加入无钙、镁离子的PBS,反复用吸管吹打使细

胞脱落，将细胞移入离心管。

②以1000r/min离心5min,去上清液。加PBS,重复2~3次。

③加PBSO.5mI,振荡使细胞分散。

④加入-20℃冷乙醇1ml,混匀，再加入-20C冷乙醇适量，调整细胞浓度为

5~8X10A5个/ml,于-20℃保存备用。

【注意事项】

①对新鲜组织要及时处理保存，以免组织在室温下放置时间过长而产生中

心组织坏死或细胞自溶，影响FCM结果。

②根据实验目的选择最佳的固定方法，以免由于固定剂原因，造成FCM检

测结果不稳定。

③酶法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂、消化时间、pH值、

浓度等方面对酶消化发的影响。

④要根据不同组织选择相应的方法。FCM快速进行各种参数的分析必须以

单细胞为基础，为实现单细胞产率高、损伤少的目的，对不同的样本采

用不同的方法制备单细胞悬液。

III.细胞蛋白质总量分析

【原理与应用】

异硫氟酸荧光素（FITC）是检测细胞蛋白总量最常用的荧光探针。

它是酸性染料•，能以共价键方式结合到蛋白质带正电荷的基团上。以蓝

色激光激发可以发出明亮的绿色继发荧光。绿色继发荧光的强度与细胞

的蛋白质含量正相关。

测定细胞蛋白总量可以检测•个细胞群体生长和代谢的状态，也能

区别蛋白含量不同的样品。

第三节细胞增殖与凋亡

1.细胞增殖

细胞物质储备和细胞分裂是一个相互连续的过程，这一过程即称为细胞增殖

(cellproliferation)o将细胞增殖的循环过程构成了细胞周期(cellcycle),一

个完整的细胞周期包括分裂间期和分裂期。一个细胞周期是一个细胞的整个

生命过程，即一个细胞经过生长、准备并最终变成两个新的细胞。因此，通

过对细胞增殖的研究可以观察、判断细胞所处的时期以及生长状况，也就是

说，对细胞增殖的研究可以通过细胞生长的研究来实现。

⑴MTT检测细胞生长

【原理与应用】

MTT的化学名称为甲基曝陛基四哇，商品名为嘎哇蓝，可接受氢原子而

发生显色反应。活细胞中的线粒体具有琥珀酸脱氢酶，能够使外源性的

MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，而死细胞缺乏线粒体活性，因而无

此活性。蓝紫色结晶可以溶解在二甲基亚碉中，应用酶标仪可以检测其

吸光值，并根据吸收值的高低判断细胞数量。

【实验用品】

①材料待测细胞，96孔培养板，枪头，10ml吸管橡皮头，小烧杯。

②试剂二甲基亚碉(DMSO),PBS,MTT溶液。

③设备与工具超净工作台，C02孵箱，倒置相差显微镜，混合振荡器，水

浴锅，酶联免疫检测仪，移液器。

【试剂配制】

MTT溶液:称取250mgMTT,在50ml0.01mmol/lPBS(pH7.4)中溶解，

并用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存，有效期2周。

【实验操作】

①取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2X10A3~5X10A4个细胞的培养

液。

②在37℃、5%CO2的饱和水汽C02培养箱中4d,让细胞贴壁（如果是悬

浮细胞可直接进行下-一步）。

③吸去培养液，用PBS洗涤1次（如为悬浮细胞，应该吸去上清液前离心

培养板）。

（4）每孔加O.lmIPBS和10口IMTT染液,在37℃5%CO2的饱和水汽培养箱

中培养4-6ho

⑤将培养液分两组：一组，小心吸取孔内的上清液（对悬浮细胞要离心，

离心后弃上清液），弃去上清液并加入150W的DNSO,振荡lOmin,使

紫色结晶溶解；另一组，用0.25%胰酶消化，并用培养基调整使体积达

到200PI,细胞悬液在计数板上计数细胞。

⑥在酶联免疫检测仪上，以检测波长570nm、参考波长630nm测定各孔

吸光值（OD值），记录结果。

【注意事项】

①酶联免疫检测仪检测OD值仅在适当的细胞浓度时与细胞数目呈线性关

系。因此，在实验时，必须将细胞调整到适当浓度。

②设空白对照。与试验孔平行设定不加培养基的空白对照孔，其他实验步

骤保持一致。比色时，以空白孔调零。

2.细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosis）亦称细胞程序凋亡（programmedcelldeath,PCD）,是

细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡过程。

⑴Hoechst33342染色法

【原理与应用】

Hoechst33342为特异性DNA染料,能与A-T键结合，但在pH2.0环境

则优先与RNA结合，适当调整染液的pH至7.0,这种染液对死细胞或经70%

冷乙醇固定的细胞可立即染色，而活细胞的着色是渐进性的，在10min内可

以饱和。

【实验用品】

①材料。活体细胞。

②试剂。Hoechst33342染液,无Ca2+、Mg2+PBS(pH7.2),封片液(pH

5.5)o

③设备与工具。荧光显微镜。

【试剂配制】

①Hoechst33342染液。Hoechst33342用双蒸水配成1mg/mL,pH7.0染色

液。

②封片液(pH5.5)o20mmol/mL柠檬酸，50mmol/mL磷酸氢二钠，50%甘

油。(是否有成品？)

【实验操作】

①将Hoechst33342加入培养的细胞中，终浓度为10ug/mL,于37℃孵

育30min。

②4%多聚甲醛和培养液以1:3混合，使多聚甲醛浓度为1%,固定细胞

5~10min.

③固定好后，将细胞悬液涂在载玻片上，并加盖玻片。

④荧光显微镜观察。荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片，阻断滤片为

400~500nmo

【注意事项】

这种染料不溶于磷酸盐缓冲液，所以配制时必须先以蒸储水溶解配成储存液,

在4℃避光保存。如溶液出现絮状物或沉淀，即不可使用。染色时间不能太

长，否则会有假阳性现象。

【实验结果与分析】

在荧光显微镜下，活细胞核呈现出弥散、微弱的荧光。出现凋亡时，细胞核

或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光(蓝色)，并且细胞核形态也有明

显变化。如果见到3个或3个以上的DNA的荧光碎片-，则认为是凋亡细胞。

该法是利用凋亡细胞对Hoechst33342摄取增强的特点，由于不同细胞对

Hoechst33342摄取各异，故该法不一定适合所有细胞。

⑵流式细胞仪方法

I.PI染色

【原理与应用】

碘化丙咤(propidiumiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，

但对凋亡晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核呈红然。

【实验用品】

①材料细胞，400目筛网。

②试剂PBS溶液，PI染液，70%乙醇。

③设备与工具流式细胞仪。

【试剂配制】

PI染液：将PI溶于PBS(pH7.4)中，中浓度为100ug/mL。用棕色瓶4℃避

光保存。

【实验操作】

①收集细胞1X10八6个，于500~1000r/min离心5min,弃去培养液。

②用lmlPBS/FSC洗1次。

③以500-1000r/min离心5min去PBS/FCS,力H入500uLPBS/FCS和500nL

的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。

④以500~1000r/min离心5min弃去固定液,室温加入含0.2%吐温的PBS1mL,

于37℃孵育15mino

⑤用ImLPBS/FCS洗3次，每次5min。

⑥400目的筛网过滤1次。

⑦以500~1000r/min离心5min去PBS/FCS,用1.0mLPI染液,于4℃避光

保存至少30mino

⑧流式细胞仪检测：染色在24h之内皆可行。PI用僦离子激发荧光，激光

光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光。分析前

散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

【注意事项】

细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种

DNA可燃性降低也可能是因为DNA含量降低，或者是因为DNA结构的改变

使其与燃料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

【实验结果与分析】

在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比,

前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞类型有关。

在分析PI荧光的直方图时，先排除成双或聚集的细胞以及法微弱荧光

的细胞碎片。在PI荧光直方图上，凋亡细胞在G3/G0期前出现一个亚二倍

体峰，如以G3/G0期所在位置的荧光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞样

本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45。可用鸡和鞋鱼的红细胞的PI荧光强度作

参照标准，两者分别为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而

是完整的细胞。

II.Hoechst3334/PI染色

【原理与应用】

流式细胞仪通常根据细胞完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，正

常细胞和凋亡细胞可归为活细胞。活细胞染料如Hoechst33342能少许进入正

常细胞膜，对细胞也没有太大毒性作用。Hoechst33342在凋亡细胞中荧光强

度要比正常细胞中的高，它在凋亡细胞中荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜

通透性发生改变有关。凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细

胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst33342比正常的细胞

多。此外，凋亡细胞的染色体DNA结构发生了变化，从而使该染料能更有效

地与DNA结合。凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤，不能有效地将

Hoechst33342排除细胞外，因而使之在细胞内积累增加。

Hoechst33342进入凋亡细胞要比正常细胞容易，而EB、PI或7-AAD等

染料不能进入细胞膜完整的活细胞中。正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情

况下对EB、PI、7-AAD等染料拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期已破损，

可被这些染料染色。根据这些特性用Hoechst33342结合PI或EB等染料对凋

亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和死亡细胞

区分开来。

【实验用品】

①材料细胞，400目筛网。

②试剂Hoechst33342染，PI染液。

③设备与工具流式细胞仪。

【试剂配制】

①Hoechst33342染液用PBS配成10ug/mL的储存液，于4℃避光保存。

②PI染液用PBS配成5Ng/mL溶液，于4℃避光保存。

【实验操作】

①悬浮生长细胞在培养状态下加入Hoechst33342,终浓度为1口g/mL；贴

壁生长的细胞用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶消化成单细胞悬液，离心，

弃上清液，用1mL全培养液重悬细胞，加入Hoechst33342,终浓度为1

Ug/mL,于37℃孵育7~10mino

②于4℃低温500~1000r/min离心5min,弃去染液。

③加入1.0mLPI染液，于4℃避光染色15min。

④400目的筛网过滤1次。

⑤流式细胞仪分析：Hoechst33342用氟激光激发紫外线荧光，激发光波波

长为352nm,发射光波波长为400~500nm,产生蓝色荧光；PI用显激光

激发荧光，激发光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红

色荧光。分析蓝色荧光对红色荧光散点图或地形图。

【注意事项】

①在红色荧光对蓝色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁

移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

②用Hoechst33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min

内，如果时间太长可引起Hoechst33342的发射光谱由蓝光向红光迁移，

导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变，从而影响实验结果。

【实验结果分析】

正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoechst

染料］虽然呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙咤(PI)而呈强红

色荧光。在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常

细胞为低蓝色/低红色荧光(Hoechst33342+/PI+),凋亡细胞为高蓝色/低红色

(Hoechst33342++/PI+),死亡细胞为高蓝色荧光/高红色荧光(Hoechst

33342++/PI++)o

第四章细胞的培养与分离

第一节细胞培养的基本方法和技术

1.细胞的原代培养

细胞的原代培养（primaryculture）或初代培养是指从供体直接分离的组

织细胞的首次培养。原代细胞离体时间段，具有二倍体遗传性，在一定程

度上能反应其在体内的生长特性，适合于进行药物测试、细胞分化和转化

等实验研究。在临床研究中，短期原代培养细胞的移植疗效明显高于未经

培养的组织细胞。因此体外培养人的各种组织细胞，尤其是上皮细胞，对

于研究各种疾病的发生。发展及防治都具有重要意义。根据实验目的以及

实验材料的不同，分离及培养细胞的方法和条件各有不同。

一般常用方法有两种：一是组织块培养法；一是消化培养法。

（1）组织块培养法

【原理与应用】

组织块培养法是常用的、简便并且成功率较高的原代培养方法，即将组

织剪切成小块后，直接接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长需要作相

应处理。例如为了利于上皮细胞等细胞的生长，可以在生长面预先涂上胶原

薄层。如果原代细胞准备做组织染色记忆电镜等进一步检查，可在原代培养

之前先在培养瓶内放置清洗干净的盖玻片。并在放入组织块前预先用1~2滴

培养液湿润瓶底，使盖玻片固定在瓶底。组织块培养法操作简便，部分种类

的组织细胞在小块贴壁培养24h后，就有细胞从组织块四周游出。但由于在

你反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个组织都能长出细胞，

只适合于组织量少的原代培养，如牙髓细胞培养等。

【实验用品】

①材料泡沫塑料板或木