通关藤致U937 细胞凋亡效应与机制

通关藤致U937细胞凋亡效应与机制

摘要：目的：研究通关藤对U937细胞凋亡效应与调控及周期改变。方法：应用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度通关藤对U937细胞的增殖抑制作用，以Annexin-Ⅴ/PI双染法检测细胞凋亡，以RT-PCR法检测bax、bcl-2、p53的基因表达水平的改变。结果：10、20、40、80μL/mL通关藤对U937细胞染毒24h后，细胞相对增殖率为93.33%、86.20%、76.42%、56.75%，10、20、40、80μL/mL通关藤对U937细胞染毒24h后的凋亡率为5.67%、7.51%、13.49%、21.61%，10、20、40μL/mL通关藤对U937细胞染毒24h后bax/bcl-2的比值为1.35、2.58、4.45，p53的相对表达水平为1.57、2.36、3.57。结论：通关藤能抑制U937细胞生长，诱导细胞发生凋亡，且具有剂量反应关系，其凋亡的机制可能与Bax/Bcl-2的上升，及p53的mRNA表达的上调有关。关键词：通关藤；U937细胞；细胞毒性；Bax/Bcl-2；P53近年来，传统中药通关藤在实体瘤的临床治疗中取得了较好的疗效[1-3]。但通关藤注射液在血液肿瘤治疗中应用较少。有研究表明，低浓度的通关藤可诱导白血病NB4细胞分化，高浓度可通过线粒体途径诱导白血病细胞U937，HL60凋亡[4-5]。为进一步探讨通关藤抗白血病的作用及相关凋亡的可能机制，本文用体外对U937细胞进行不同浓度的通关藤染毒，观察对U937细胞的抑制作用，对细胞凋亡、细胞周期的影响并检测相关基因的表达。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株：U937细胞购自中科院上海细胞库。1.1.2主要试剂及仪器：通关藤注射液(消癌平注射液，20mL/支，批号:20070405111)、凯基活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；MithrasLB941多功能酶标仪（德国Bertholdtechnologics），PCR仪(Eppendorf-AG)，凝胶成像处理系统(ChemilmagerTM5500Alphainnotech)，ABI7300型荧光定量PCR仪（美国应用生物系统中国公司）。1.2方法1.2.1通关藤对U937细胞的增值抑制作用以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基正常培养细胞。实验时取对数生长期细胞以1×104个/孔接种于96孔培养板中培养24h，用含通关藤终浓度为，10、20、40、80μL/mL的培养基100μl染毒24h，每个剂量设3个平行。染毒结束后吸取培养基，加入含10%MTT的无血清培养基100μl作用4h，再吸取培养基，加入150?lDMSO溶解蓝紫色结晶物，每孔平行吸取三次各150?l到96孔板在酶标仪上选择490nm波长测定各孔吸光度值(A)。按公式计算各组细胞相对增值率，细胞相对增值率(%)=(各染毒组A值-空白组A值)×100%/（阴性对照A值-空白组A值)。1.2.2通关藤对U937细胞凋亡作用取对数生长期细胞以2×105个/孔接种于六孔培养板中培养24h。剂量效应研究：用含通关终浓度为0、10、20、40、80μl/ml的培养基3ml分别染毒24h；每组设3个平行。染毒结束后，胰酶消化，离心（2000转，5min）收集细胞，用PBS洗涤细胞2次（2000转，5min），加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞；加入5μLAnnexinV-FITC混匀后，加入5μLPropidiumIodide，混匀。室温，避光，反应15min。用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm；发射波长Em=530nm。AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测。1.2.3通关藤对U937细胞Bax、Bcl-2和p53表达影响同以上染毒方法获取细胞，trizol法提取总RNA，用RT-PCR方法检测肿瘤细胞Bax、Bcl-2和p53基因表达。设计引物如下：Bax引物：上游：5’-GGTGCCTCAGGATGCG-3’，下游：5’-GGAGTCTGTGTCCACG-3’，扩增片段115bp；Bcl-2引物：上游：5-TCGATGTGATGCCTCTGCGAAGAAC-3’，下游：5’-ATTGCACTGCCAAACGGAGCTG-3’，扩增片段112bp；以β-actin为参比基因：上游：5’-ATCCGCAAAGACCTGT-3’，下游：5’-GGGTGTAACGCAACTAAG-3’，扩增片段293bp。反应条件：9