生物化学课件五、酶促反应的速度及其影响因素

生物化学课件五、酶促反应的速度及其影响因素根据中间产物学说，酶促反应分两步进行:米氏方程的推导：推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想进行推导。

米氏常数Km的意义:由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]

上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。Km值(近似)表示（当k3<<k2）酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。

酶被底物饱和的百分数:

已知Km值和底物浓度，求v相当于Vmax的百分率？（P360）寻找限速步骤：

Km值最大者为限速步骤Vmax和k3(kcat)的意义:在一定的酶浓度下，Vmax是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。当[S]很大时，Vmax=K3[E]K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat），表明酶的最大催化效率。转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒测定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作图法—双倒数作图法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数Km的测定：2.多底物的酶促反应动力学分类：单底物反应、双底物反应、三底物反应（1）序列反应或单－置换反应A、有序反应；B、随机反应（2）乒乓反应或双－置换反应

1.多底物酶促反应按动力学机制分类①有序反应只有Leadingsubstrate(领先底物A)首先与酶结合，然后B才能与酶结合，形成的三元复合物EAB（ternarycomplex)转变为EPQ，B的产物P先释放，A的产物Q后释放。★在缺少A时，B不能与E结合E+A+B→AEB→PEQ→E+P+Q（1）序列反应E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQPEAAEAEBQEPBQEQA与其产物Q相互竞争地结合E，但A和B互不竟争反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数NAD＋与NADH相互竞争E上的NAD＋结合部位②随机反应底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物AEB→QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。限速步骤是AEB→QEPA与Q相互竞争E上的底物结合部位A，B与P相互竞争E上的底物结合部位B反应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反应的平衡常数（2）乒乓反应底物A先与E结合成AE二元复合物，AE→PF（修饰酶形式），释放第一个产物P，接着底物B与F形成FB，FB→EQ，释放第二个产物Q。A与Q竞争自由酶形式E，B与P竞争修饰酶形式F。整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式。3.抑制剂对酶反应的影响有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为酶的抑制作用。（比较：失活作用P368）能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂（inhibitor)。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。抑制作用的类型：(1)不可逆抑制作用：抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活，即酶的修饰抑制。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。（2）可逆抑制作用：

抑制剂与酶以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根据抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：I．竞争性抑制：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争和酶活性中心结合。当抑制剂与活性一中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制。竞争性抑制通常通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。竞争性抑制可用下式表示：有竞争性抑制剂存在时，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值随[I]的增高而增大；在[E]固定时，当[S]﹥﹥Km(1+[I]/Ki),Km(1+[I]/Ki)项可忽略不计，则v=Vmax，即最大反应速度不变。竞争性抑制作用的速度方程：竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图：非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。非竞争性抑制可用下式表示：有非竞争性抑制剂存在时，V值减小(1+[I]/Ki)倍，且V值随[I]的增高而降低；Km值不变。非竞争性抑制作用的速度方程：非竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图：有反竞争性抑制剂存在时，Km和V值均减小(1+[I]/Ki)倍，且都随[I]的增高而降低。反竞争性抑制：酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。反竞争性抑制可用下式表示：反竞争性抑制作用的速度方程：反竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图：(3)可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别1、通过透析、超滤、凝胶过滤等2、通过v-E速度曲线[E]v123(1)反应体系中不加I。(2)反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂。(3)反应体系中加入一定量的可逆抑制剂。[E]v不可逆抑制剂的作用[E]v可逆抑制剂的作用[I]增高→[I]增高4.激活剂对酶反应的影响（P380）凡是能提高酶活力的物质都称为激活剂（activator)。其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；选择性：一般情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一种酶则可能起抑制作用；对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。4.酶浓度对酶反应的影响在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度和酶浓度成正比。5.温度对酶反应的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。最适温度6.pH对酶反应的影响在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。7.酶的别构（变构）效应：(P418)由于效应物的存在，而引起酶的结构（构象）变化。别构酶(Allostericenzyme)的特点：一般是寡聚酶，由多亚基组成，包括催化部位和调节（别构）部位；具有别构效应。指酶和一个配体（底物，调节物）结合后可以影响酶和另一个配体（底物）的结合能力。相同（均为底物）：同促效应（homotropiceffect）不同（效应调节物）：异促效应（heterotropiceffect）根据配体结合后对后继配体的影响根据配体性质正协同效应（positivecooperativeeffect）负协同效应（negativecooperativeeffect）动力学特点：不符合米氏方程双曲线。别构酶与非调节酶动力学曲线的比较1--非调节酶2--正协同别构酶3--负协同别构酶

具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却较小。使得酶反应速度对底物浓度的变化不敏感协同指数（cooperativityindex,CI）：指酶分子中的结合位点被底物饱和90%和饱和10%时底物浓度的比值。位点被底物饱和90%时底物浓度Rs=＝81位点被底物饱和10%时底物浓度Rs：饱和比值（saturationratio）;n:Hill系数(1)符合米氏方程的酶：Rs＝81,n=1;(2)正协同效应酶：Rs＜81,n＞1;(3)负协同效应酶：Rs＞81,n＜1。1n别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase8.固定化酶固定化酶是通过吸附、耦联、交联和包埋等物理或化学的方法把酶连接到某种载体上，做成仍具有酶催化活性的水不溶性酶。作用特点：稳定性提高，易分离，可反复使用，提高操作的机械强度。六、酶的分离纯化与酶活力测定P3351.酶的分离纯化基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液.基本操作程序：选材：微生物（微生物发酵物:胞内酶，胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等）。抽提：加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等），分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。酶的结晶与制剂形式：固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）液体保存：低温下短期保存；浓度越低，越难保存。2.酶活力的测定概念酶活力：又称为酶活性，一般把酶催化某一化学反应的能力称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速率来表示。基本原理:酶是蛋白质，种类多，结构复杂多样，一般对酶的测定，不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反应的能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即V=K［E］），故酶活力测定的是化学反应速率，一定条件下可代表酶活性分子浓度。

酶活力测定酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物(P)的生成（增加）量或底物（S）的消耗（减少）量。即测定时确定三种量：①加入一定量的酶；②一定时间间隔；③物质的增减量。测定酶活力的方法：在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化学反应量（终止时与起始时的浓度差），这时测得的是初速度。酶反应条件优化：测酶活所用的反应条件应该是最适条件，所谓最适条件包括最适温度、最适pH、足够大的底物浓度、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。

酶活力测定方法：反应计时。反应计时必须准确。反应体系必须预热至规定温度后，加入酶液并立即计时。反应到时，要立即灭酶活性，终止反应，并记录终了时间。终止酶反应，常使酶立刻变性，最常用的方法是加入三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀，也可用SDS使酶变性，或迅速加热使酶变性。有些酶可用非变性法来停止反应或用破坏其辅因子来停止反应。反应量的测定。测底物减少量或产物生成量均可。在反应过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物的生成量。

具体物质量的测定，据被测定物质的物理化学性质通过定量分析法测定。常用的方法有：光谱分析法：酶将产物转变为（直接或间接）一种可用分光光度法或荧光光度法测出的化合物。电化学法：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性（如pH测定法）。放射性化学法：用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。

3.酶活力的表示方法及计算酶活力单位酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示，单位为mol/min等。酶活力单位的基本定义为：在一定条件（最适条件）下，一定时间内将一定的底物转化为产物所需的酶量。据不同情况有几种酶活力单位（activityunit）或又称酶单位（enzymeunit）。国际单位：一般用活力单位U（Unit）表示，许多酶活力单位都是以：最佳条件或某一固定条件下，每分钟催化1μmol底物转变为产物所需要的酶量为一个酶活力单位。一个“Katal”单位是指在最适条件下，1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。Kat和U的换算关系：1Kat=60×106U，1U=16.7

nKat在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。

习惯单位：在实际使用中，不同酶有各自比较方便、直观的酶活力单位的规定，如：①α-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。（QB546-80），也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。②糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。③蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。④DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1μg纯化的DNA所需的酶量。

比活力（specificactivity）酶的比活力是指每单位（一般是mg）蛋白质中的酶活力单位数（如：酶单位/mg蛋白），实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂）），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。

回收率（产率）=某纯化操作后的总活力/第一次操作前的总活力［总活力=比活力×总体积（总重量）］

本章小结一、酶酶的概念酶催化作用的特点共性特性：条件温和、高效率、专一性、易变敏感性二、酶的化学本质及结构功能特点酶：单纯酶结合酶：全酶=酶蛋白+辅因子酶的辅因子维生素和辅酶维生素是机体维持正常生命活动所必不可少的一类小分子有机物质。维生素一般习惯分为脂溶性和水溶性两大类。辅酶是一类具有特殊化学结构和功能的化合物。参与的酶促反应主要为氧化-还原反应或基团转移反应。大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。酶结构与功能特点(1)活性中心：结合部位、催化部位、调控部位(2)必须基团(3)酶原和酶原的激活(4)同功酶三、酶的分类及命名四、酶作用的机制1.酶催化作用的本质：降低反应活化能2.酶催化作用的中间产（络合）物学说

E+S====E-S

P+E3.酶与底物结合形成中间络合物的方式：锁钥假说、诱导契合假说4.使酶具有高效催化的因素临近和定向效应“张力”和“形变”酸碱催化共价催化，等五、酶促反应的速度及其影响因素1.底物浓度对酶促反应速度的影