均相免疫分析技术Bindingssay

均相免疫分析技术-BindingAssay5/8/20241均相免疫分析技术Bindingssay目录TR-FRET：时间分辨荧光共振能量转移Time-resolvedFluorescenceResonanceEnergyTransferAlpha：放大化学发光亲和均相检测AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay5/8/20242均相免疫分析技术BindingssayTR-FRETTime-resolvedFluorescenceResonanceEnergyTransfer，时间分辨荧光共振能量转移。该技术结合了荧光共振能量转移（FRET，FluorescenceResonanceEnergyTransfer）和时间分辨（TR，TimeResolved）两种技术。5/8/20243均相免疫分析技术BindingssayFRET：荧光共振能量转移FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor，有铕或铽两种)和能量受体(Acceptor，有XL665或d2两种)，

Donor的发射光谱与Acceptor的激发光谱重叠。Donor被外来能源激发后，其发射波谱在620nm处有一波峰，如果它与Acceptor在足够近的距离之内(10nm内)，可以将能量共振转移到Acceptor上。Acceptor受到激发，发出特定波长（665nm）的发射光。Donor发射光谱XL665激发和发射光谱虚线为激发光谱发射光谱为阴影部分5/8/20244均相免疫分析技术BindingssayFRET：荧光共振能量转移将Donor和Acceptor分别偶联在相互作用的两个生物分子上，生物分子的结合可以将Donor和Acceptor拉到足够近的距离，产生能量转移。由于Acceptor分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中无需将未结合与已结合的分子分开，可实现均相检测。发生FRET需要两个条件：1、Donor的发射光谱与Acceptor的激发光谱重叠。2、

Donor与Acceptor之间距离必须在10nm内。5/8/20245均相免疫分析技术BindingssayFRETDonorDonorAcceptor5/8/20246均相免疫分析技术BindingssayTR：时间分辨TR技术是利用稀土元素中镧系元素铕(Eu)或铽(Tb)的独特性质，其荧光比普通荧光持续时间更长。普通荧光的半衰期为纳秒级（ns），镧系元素的半衰期为毫秒级（ms），有6个数量级的差别。5/8/20247均相免疫分析技术BindingssayTR:时间分辨在检测时，TR有一个时间延迟约100微秒，经过这个时间延迟，普通荧光的信号几乎为零。因此TR的背景非常低，反映样品实际情况。5/8/20248均相免疫分析技术BindingssayTR-FRET：时间分辨荧光共振能量转移Donorlong-live

fluorescence(ms)Acceptorshort-livefluorescence(whennotengagedinFRET)(ns)340nm665nmSpectralselectivityEu3+

orTb3+

cryptateXL665ord2Temporalselectivity5/8/20249均相免疫分析技术BindingssayTR-FRET优势将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特点融合在一起，使得TR-FRET技术拥有操作简单、通量大、实验数据稳定可靠、假阳性率较低的优势；采用双波长检测能够显著减少实验体系的干扰，最终的信号与产物形成的量成比例。TR-FRET技术也可以取代大部分ELISA，因为TR-FRET具有同等的检测范围和检测极限，而且更节省实验时间，并且不需要洗板的步骤，所以该技术近年来已被应用于抗体的活性检测。5/8/202410均相免疫分析技术BindingssayTR-FRET举例分享TR-FRET竞争法测定人源RANKL单抗拮抗RANKL与RANK结合活性。5/8/202411均相免疫分析技术Bindingssay试剂选择Anti-TagReagents

Europium

Terbium XL665d2

Anti-GST(GSS11)

Anti-6HIS(HIS-1)

Anti-c-myc(9E10)

Anti-FLAG

(M2)

Anti-HA(HAS01)

AntiMBP

Anti-DNP

Anti-ImmunoglobulinReagents

Europium XL665 Anti-humanIg

(&d2)

Anti-mouseIg

(&d2)

Anti-rabbitIg

ProteinA

AffinityReagents

EuropiumXL665 Streptavidin (&Tb) (&d2)

LabelingkitsEuropium Lumi4®-Terbium d2

5/8/202412均相免疫分析技术BindingssayTR-FRET举例分享TR-FRET竞争法测定抗体拮抗RANKL与RANK拮抗活性Donor：Streptavidin-Eu，重组人RANK标记Biotin，重组人RANKL标记上Acceptor，620nm和665nm检测RANKL与RANK结合信号。加入梯度稀释的Sample（抗体），抗体与RANKL结合，可拮抗FRET信号的产生。随着抗体浓度的梯度增加，荧光信号呈现剂量曲线关系。加入抗体5/8/202413均相免疫分析技术BindingssayTR-FRET举例分享TR-FRET竞争结合活性曲线图谱检测：340nm激发光分别读取620nm和665nm荧光信号关键参数设置为：Lagtime=50μs-150μs，

Integrationtime=200μs-400μs。拟合DeltaF%vsconcentration的曲线数据处理：所得数据需要转换成DeltaF%，DeltaF%的计算方法为：Ratio=Signal665nm/Signal620nmDeltaRatio=Sample(orSTD)Ratio-NCRatioDeltaF%=DeltaRatio/NCRatio*100NC为negativecontrol；EC50=C×[2(1/G)-1](1/B)5/8/202414均相免疫分析技术BindingssayTR-FRET缺陷分子间有效距离受限，不易检测较低信号水平。5/8/202415均相免疫分析技术Bindingssay利用供体微珠（Donorbeads）和受体微珠（Acceptorbeads）来检测生物分子的相互作用，微珠表面覆盖了一层水凝胶，作为生物连接的功能基团。供体微珠含有光敏剂-酞菁，在680nm的光照射后将它周围环境中的氧分子转化为高能活跃的氧状态-单体氧。单体氧在其4µs的半衰期内可在溶液中扩散高达200nm的距离。如果在该范围内存在受体微珠，单体氧再与邻近的受体微珠上的二甲基噻吩化合物产生化学冷光反应，产生冷光效应(波长大约370nm)，继而通过激发一系列的化学反应，最终让受体微珠在520-620nm产生荧光信号。如果两种微珠的距离超过200nm，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生。在680nm波长的激发下，每个供体微珠能够释放60,000单体氧每秒，产生非常高的信号放大。由于单体氧非常不稳定，此反应相当快速仅4μs，加上供体微珠和受体微珠距离超过200nm，反应随之下降，所以只有抗原抗体分子结合才能触发反应，通过测定荧光量来反映抗体的活性。

Alpha—AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay放大化学发光亲和均相检测5/8/202416均相免疫分析技术BindingssayAlphaALPHA技术包括AlphaLISA和AlphaScreen两种检测方法。两种方法都使用同一种供体微珠，但使用不同的受体微珠。5/8/202417均相免疫分析技术BindingssayAlphaScreenbeadsSiNNNNNNNNOSiSiODonor:Phthalocyanine（酞菁）O2680nmDO1g2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2340-350nmAcceptorbeads检测波长:520-620nmDonorbeads450-500nm1O2SignalAmplificationAlphaScreen受体微珠上包埋了三种染料：二甲基噻吩，蒽和红荧烯。最终发光的荧光染料红荧烯会在520-620nm的波段发出可检测光。5/8/202418均相免疫分析技术BindingssayAlphaLISAbeadsSiNNNNNNNNOSiSiODonor:Phthalocyanine（酞菁）O2680nmDO1g2AlphaLISAbeads检测波长:607-623nmDonorbeads1O2SignalAmplificationOSNOSNOO1DgO2OSNenergytransferOSNOO1DgO2Europium在AlphaLISA受体微珠中，蒽和红荧烯被一种镧系元素铕(Europium)螯合物替代。被激发的铕螯合物可以在615nm左右形成波段更窄的更强的可检测光。该反应的半衰期为0.3秒，可使用时间分辨的方法检测。5/8/202419均相免疫分析技术BindingssayAlphaLISA和AlphaScreen发射光谱对比与AlphaScreen相比，AlphaLISA受体微珠的信号更强，受到介质干扰更少。5/8/202420均相免疫分析技术BindingssayALPHA优势：均相体系、快速、稳定，避免了空间位阻影响生物分子的相互结合，适用于高通量筛选；具有非常高的灵敏性。信号的产生是一系列的串联反应，由于其供体微珠上含有高浓度的感光材料以及受体微珠上含有的高密度二甲基噻吩衍生物和荧光素，在680nm波长的激发下，每个供体微珠能够释放60,000单体氧每秒，产生非常高的信号放大。通过这种串联放大反应产生的强大信号，能够检测到高达亚皮摩尔级别的化合物活性；具有非常低的背景。长波长激发，短波长发射，不会有自发光荧光的干扰。检测模式为时间分辨荧光，能够消除几乎所有的来自体系或者板子荧光背景，进一步降低了背景，确保结果的真实性；具有高信噪比。由于其较高的信号值以及较低的背景值，所以具有很高的信噪比；ALPHA技术还具有灵活多变的实验设计，其检测的范围既可以是低亲和力的结合，也可以是强亲和力的结合。无论是酶的活性实验，还是受体配体反应，第二信使水平的检测，GPCR的功能研究，DNA，RNA，蛋白质，多肽，糖类，小分子，大分子以及巨大结构的复合物等等的复合物相互作用都可以通过ALPHA技术来检测。绝大多数的ELISA实验都可以轻松地转换ALPHA技术实验平台。5/8/202421均相免疫分析技术BindingssayAlpha举例分享AlphaScreen竞争法测定人源PD1单抗拮抗PDL1与PD1结合活性5/8/202422均相免疫分析技术Bindingssay试剂选择5/8/202423均相免疫分析技术BindingssayAlphaScreen举例分享StreptavidinDonor；NichelateAlphaScreenAcceptor；重组人PDL1标记Biotin;His标签重组人PD1;检测PDL1与PD1的结合信号。加入梯度稀释的Sample（抗体），可拮抗荧光信号的产生，并且呈现剂量曲线关系。荧光信号对浓度拟合曲线，可得EC50，标准品EC50与样品EC50的比即是相对拮抗活性。AlphaScreen竞争法测定抗体拮抗PDL1