基因表达的定量检测分析

基因表达的定量检测分析1基因表达的定量检测分析5/8/2024基因表达的定量检测方法1.蛋白表达水平的检测：1）定量检测分析：westernblotting、ELISA、HPLC2）蛋白质功能分析：

蛋白质亚细胞定位分析：免疫荧光技术

蛋白相互作用研究：酵母双杂交、免疫共沉淀（IP）、

荧光共振能量转移（FRET）

酶活性检测：ELISA、HPLC2.mRNA表达水平检测：1）半定量RT-PCR2）Northernblot

3）实时荧光定量PCR（RealtimePCR）

2基因表达的定量检测分析5/8/2024Northernblot杂交

是用来检测真核生物RNA的表达量和大小，以估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：1.完整mRNA的分离2.根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离3.将RNA转移到固相支持物（尼龙膜）上，在转移的过程中，

要保持RNA在凝胶中的相对分布4.将RNA固定到支持物上（UV交联）5.固相RNA与探针分子（DNA或RNA）杂交6.除去非特异结合到固相支持物上的探针分子7.对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析3基因表达的定量检测分析5/8/2024RealtimePCR4基因表达的定量检测分析5/8/2024实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。5基因表达的定量检测分析5/8/2024实时荧光定量PCR原理

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线或内参基因的关系对起始模板进行定量分析的方法。与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。6基因表达的定量检测分析5/8/2024一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：

荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。7基因表达的定量检测分析5/8/2024

在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和

CT值。

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）8基因表达的定量检测分析5/8/2024几个常用名词概念1.Ct值的定义

C代表Cycle，t代表threshold（阈值，临界值），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。9基因表达的定量检测分析5/8/20242.荧光域值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-153.Ct值与起始模板的关系

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。10基因表达的定量检测分析5/8/2024前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的

最初阶段11基因表达的定量检测分析5/8/2024绝对定量分析：

Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系12基因表达的定量检测分析5/8/2024质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用13基因表达的定量检测分析5/8/202414基因表达的定量检测分析5/8/2024相对定量分析必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。管家基因：维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如GAPDH、Actin、HPRT等15基因表达的定量检测分析5/8/202416基因表达的定量检测分析5/8/202417基因表达的定量检测分析5/8/202418基因表达的定量检测分析5/8/202419基因表达的定量检测分析5/8/202420基因表达的定量检测分析5/8/202421基因表达的定量检测分析5/8/202422基因表达的定量检测分析5/8/202423基因表达的定量检测分析5/8/202424基因表达的定量检测分析5/8/2024优点：价格便宜，使用方便，不用设计复杂的探针。缺点：无模板特异性，对引物特异性要求比较高，

不能进行多重定量分析25基因表达的定量检测分析5/8/202426基因表达的定量检测分析5/8/202427基因表达的定量检测分析5/8/2024TaqmanProbeMolecularBeacon背景荧光更低28基因表达的定量检测分析5/8/2024反应优化反应液组成、体积50ul绝对不必要20ul应用广，但成本高推荐10ul，但需要优化引物与引物、引物与探针浓度配比4×4组合，50nm,300nm,600nm,900nm探针50nm,100nm,250nm

29基因表达的定量检测分析5/8/2024qPCR一般使用二步PCR扩增，在退火-延伸整合步骤结束时进行信号检测。当PCR反映效率低时可以使用三步PCR扩增。染料法可以在72℃延伸结束时检测。探针法只能在退火结束时检测。30基因表达的定量检测分析5/8/202431基因表达的定量检测分析5/8/202432基因表达的定量检测分析5/8/202433基因表达的定量检测分析5/8/202434基因表达的定量检测分析5