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主讲老师：陈郁生物制药技术专业教学资源库紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法及其应用

紫外-可见分光光度法是在190~800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin紫外-可见分光光度法及其应用

因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸光度比值而鉴别物质。用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度（朗伯-比尔定律A=lg(1/T)=Kbc）。含量测定一般有以下几种方法：对照品比较法、吸收系数法、计算分光光度法、比色法。基本结构图紫外-可见分光光度计结构图比色皿须洁净01手指拿毛玻璃面的两侧02透光面用擦镜纸从上而下擦拭干净03柔红霉素使用多个比色皿时，需配对使用（透光率相差在0.3%以下）04氮芥比色皿注意事项波长小于300nm须使用石英比色皿05紫外-可见分光光度计的校正1.波长：由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对所用仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长，常用高氯酸钬溶液校正双光束仪器，仪器波长的允许误差为：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm2.吸光度的准确性：可用重铬酸钾的硫酸溶液检定，检定要求见表格紫外-可见分光光度计的校正紫外-可见分光光度计的校正3.杂散光的检查：可用1.0%碘化钠，5.00%亚硝酸钠，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定1.对溶剂的要求：含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置1cm石英吸收池中，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质）测定其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度，在220~240nm范围内不得超过0.40，在241~250nm范围内不得超过0.20，在251~300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上时不得超过0.05。注意事项01测定时，一般供试品溶液的吸光度读数，以在0.3~0.7之间为宜。02仪器的狭缝波带宽度宜小于供试品吸收带的半高宽度的1/10，否则测得的吸光度会偏低。03吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸光度后应减去空白读数，或由仪器自动扣除空白读数后再计算含量。04当溶液的p

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