《细胞与免疫学技术与原理》精讲

第二讲细胞培养技术二

动物细胞培养可以在同一时期、相同条件、相似性状的条件下提供大量的实验样本，开展科学研究，相对耗资较少，因而成为生物制品、单克隆抗体和基因工程制品生产的重要手段。第一节

动物细胞原代培养概念：从供体获得组织细胞为材料，进行首次培养，称为细胞的原代培养或称细胞的初代培养。

原代培养的细胞特点：（1）原始性（2）不均一性

理论：各种动物和人体内所有组织都可进行培养。实际：幼体组织尤其是胚胎组织比老年的易培养；分化程度底的组织比分化程度高的易生长；肿瘤组织比正常组织容易培养。一、取材一般要求：

无特定的要求时，取容易培养的组织进行培养，成功率高。取材后最好立即培养，因故不能培养时，应把组织切成1cm3左右的小块，置培养液中，4℃储存，存放时间不宜超过24小时。

因为时间越长、组织块越大细胞越易死亡。从体内取材时，应严格保持无菌，严防有害物污染，如化学药物、试剂、射线等。取组织时要作好记录，如动物、性别、年龄、部位、种类和疾病，以便与日后实验结果相比较。常用取材方法举例：1、取体液

主要指取血液，血液是白细胞的主要来源。有指尖取血和静脉取血等方法。指尖取血2、取人体皮肤或活检材料

（1）皮肤用75%酒精消毒；（2）用刮皮刀刮取表皮，以轻微渗血为界；（3）包扎伤口，伤口好后不留疤痕。这种取皮方法的优点是表皮细胞多，培养容易成功。如取活检组织（小儿包皮）须先准备含双抗的BSS液送入手术间，手术后储4℃冰箱。

3、取内脏和实体瘤

内脏除消化道外基本是无菌的，要明确和熟悉所需组织的类型和部位。实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染。怀孕母鼠4、取鼠胚17天的胚胎取完整鼠胚胎步骤5、取各种动物材料

先准备好一瓶含双抗的无菌PBS液，待处死动物后，迅速取出所需要的脏器组织，放入无菌PBS液内，尽快将实验材料送入超净工作台，进行细胞原代培养。

从体内取出的各种组织均由众多的细胞和纤维成分组成，且结合十分紧密，为获取大量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开来，使细胞解离出来；能达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受伤害。二、组织分离方法

适用范围：血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液。

方法：一般用500～1000r/min的低速离心，如果离心速度过大和时间太长，则易挤压细胞使之受损或死亡。

分层液：分层液根据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的，红细胞比重为1.092，淋巴和大单核等白细胞比重为1.070，分层液适用于分离血中淋巴细胞。1、离心分离法离心前离心后Ficoll分层液离心后外周血细胞示意图2、机械分散法

适用范围：某些软组织如脑、胚胎及一些肿瘤组织。

组织消化法是在把组织经过切割处理后，再用生化手段进一步分散成细胞团或单个细胞然后加入培养液。制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容易生长增殖，如：3、消化分离法胰蛋白酶消化法胶原酶消化法EDTA消化法

优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体遗传性状，供体来源充分、生物条件稳定的情况下，在一定程度上能反映在体状态。

三、细胞原代培养方法

1．组织块培养法怀孕母鼠17天的胚胎胚胎中取出的成体近端小肠

把粘膜切成小块细胞培养板中贴壁培养组织块间距1厘米取小鼠肠粘膜细胞贴壁培养组织块培养法示意图

翻转培养瓶的目的是为了使组织块微干涸，以利贴附和免从瓶壁脱落，但时间不易过长，超过4小时以上可能对组织有不利影响。

2、消化细胞培养法

单层培养的表皮细胞单层细胞培养示意图

胰蛋白酶冷消化法

胰蛋白酶热消化法

消化得到的细胞沉淀，用培养液配制成细胞悬液，接种到培养瓶内水平放置，37℃进行培养，每隔1～2天换培养液一次，培养一定的时间后，细胞在瓶底可长成一单层。

单层培养的神经细胞（左）和内皮细胞（右）

单层细胞培养的好处：（1）更换新鲜培养液比较容易，便于细胞从培养液摄取营养和排除代谢产物；（2）易于观察某些因子加到培养液内后的作用，以及从培养液中减去某些因子后对细胞生长的影响。（3）当细胞粘附在基底质上后，则更容易表达某些产物；（4）单层细胞培养更适用许多细胞系。（5）适合大量细胞培养。

第二节

动物细胞传代培养

原代培养过程中要不断更换新鲜培养液以维持细胞的生长。待细胞生长到一定的限度时会产生接触抑制，需要对细胞进行再培养。概念：由原代培养的细胞经消化分离后，从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为细胞传代培养或再培养。

传代培养形成的细胞群称细胞系。细胞系虽然比原代培养物的细胞组成均一得多了，但它仍不是单一细胞。必须在细胞系的基础上进行单细胞的克隆化、筛选而形成细胞株。一、需要更换新鲜培养液的提示1、培养液的pH值下降2、细胞浓度3、细胞类型4、细胞形态学二、传代培养的确定

1．细胞生长停滞，继而细胞出现脂肪滴、衰老或者组织块脱离基质漂流在培养液中。2．正常细胞生长贴满瓶壁后，由于正常细胞表面具有接触抑制，因而细胞生长受抑制。3.肿瘤细胞生长可形成多层细胞。多层细胞中，在低层部位的细胞与培养液不能直接触，结果由于营养不足而生长停滞，甚至细胞呈片状脱离瓶底而漂浮在培养中。

三、传代培养的方法1、单层细胞的传代培养（1）轻轻震荡法（2）用胰蛋白酶消化液处理（3）用EDTA溶液（4）机械刮削法消化法传代培养步骤

悬浮细胞的传代培养，不需要解离细胞一步，可直接用离心法得到细胞，然后将细胞悬于新鲜培养液内，计数，分装培养瓶，再培养。

2、悬浮细胞的传代培养

原代培养所含的细胞类型多而杂，培养初期细胞类型多种多样。随着培养时间的延长，有的细胞类型经过适应生长阶段而加速繁殖生长；而另一些细胞，或者死亡，或者经过逐步退化而至死亡。培养物的细胞类型由复杂逐步变为单一的或均匀的。

四、细胞系的建立

传代培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且使培养物逐步演变为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，称之为细胞系。

“有限”细胞系：寿命有限的细胞系。这类细胞系大多经过有限的细胞代数后，一般经20～80群体倍增后，细胞退化或死亡，其寿命长短与细胞类型和培养条件有关。

“无限”细胞系：经过再培养传代后，细胞发生转化，可连续培养和生长，寿命变为“无限”的，称谓连续培养细胞系，或“无限”细胞系。

第三节培养细胞的生物学特性一、培养细胞的形态分类1、贴附型

只依赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞或锚着依存性细胞。（1）成纤维型细胞皮肤成纤维细胞（100倍）

成纤维型细胞，细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。（2）上皮型细胞培养的血管内皮细胞3、游走型细胞游走型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞相区别。在一定条件下，由于细胞密度增大联接成片后，可呈类似多角形。（4）多形型细胞除上述三型贴附型细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们规律的形态，可统归入多形型细胞。2、悬浮型有的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，如某些癌细胞和血液白细胞可呈悬浮型。

细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时不如贴附型方便。但优点是细胞悬浮在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。二、培养细胞的生长和增殖过程

细胞在体外培养后，在一切条件适宜的情况下，最主要的活动是生长和增殖。细胞生长：细胞体积增大。细胞增殖：细胞数量增多。1、培养细胞的生命周期

组织培养细胞生命周期指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。

进行正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期传代期衰退期2、培养细胞的一代生存期

细胞“一代”仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增一代不同；细胞世代是指细胞的生命周期。而在细胞的一代中，细胞能倍增5～6次。细胞传一代，一般要经过以下三个阶段：

潜伏期指数增长期停滞期培养细胞的生长曲线

3、细胞周期一个细胞周期是从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下一次细胞分裂结束为止，这种细胞物质积累和细胞分裂的循环过程，称为细胞周期。细胞周期分为细胞间期和细胞分裂期两个阶段。4.细胞系的生长过程细胞系在培养中能够存活时间的长短，主要取决于细胞来自何种动物种族及年龄。不同的细胞体外培养可传代数不同，当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶习性转化时，细胞的生存期可能发生改变。

人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间。

恒河猴的皮肤成纤维细胞能传40代；鸡胚胎成纤维细胞最多能传30代；小鼠成纤维细胞只能传8代左右；如供体为成体或衰老个体，则生存时间更短；如培养的肝细胞或肾细胞，仅能传几代或几十代。

体外培养条件可能延迟细胞衰老，寿命从50代延至150代。当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶习性转化时，细胞的生存期可能发生改变。

第三章

培养细胞性状的检测与保存

细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液的pH是否变酸、变黄是否需要更换等。

一、细胞常规检查观察的内容

1、肉眼观察2、显微镜观察3、离体活细胞染色观察

(1)中性红染色

(2)结晶紫染色

(3)台盼蓝染色

4、固定细胞观察法

组织培养既可直接观察活细胞，也可进行固定制成永久标本观察。标本制好以后可以长期保存和做长时间的观察、分析。

5、固定细胞染色观察法

培养细胞染色有一般和特殊之分；一般染色为观察细胞一般形态之用，特殊染色为用于观察细胞特殊成分的染色方法。常用染色法：(1)Giemsa染色法

(2)苏木精-伊红（H.E.）染色法(3)Feulgen染色法(DNA特异性染色)(4)吖啶橙染色荧光观察法

二、细胞增殖生长

细胞增殖生长率是判定细胞活力的重要指标，有多种显示方法。常用方法：1.细胞计数2.生长周期的检测3.细胞周期测定4.生长晕的测量1.细胞计数

用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法。计数方法：

血细胞计数板人工计数细胞计数器计数平均值×104×稀释倍数

=细胞数/ml

计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少，可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。

2.生长周期、细胞周期的检测

任何一个细胞系在接种培养过程中均经过生长缓慢期、快速生长和最后维持稳定期的生长周期。掌握一个细胞系的生长周期，必须严格控制取样、培养时间等培养条件。

细胞周期有丝分裂细胞系生长周期曲线DT：倍增时间（doublingtime）3、流式细胞仪检测细胞周期时相和DNA合成

近年来流式细胞仪的发展已成为检测细胞增殖周期的主要手段，可进行多项检测，如细胞周期时相、DNA合成强度、持续时间等，已取代了应用同位素等繁琐方法。特别是培养细胞非常适用于做流式细胞仪检测的对象，且程序简单、快速、效果准确。4.生长晕的测量

外植块外周形成薄而透明的生长晕时，表明培养物生长正常；取生长良好的培养物观察其生长情况。从起始培养后间隔一定时间，如培养24小时和48小时，在显微镜下借用投影描画仪将组织块大小和生长晕外周轮廓画在同一张纸上。成纤维母细胞生长晕绘图

中央E为接种培养的外植块面积；A为培养6小时时的生长晕面积；B为培养12小时后的生长晕面积；C为培养24小时时的生长晕面积。三、细胞培养的污染及控制

污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

(一)细胞微生物污染的类型

细菌污染2.真菌污染3.支原体污染4.病毒污染5.非同种细胞污染（二）污染来源及鉴别

污染来源（1）不洁的动物组织标本（2）空气（3）清洗消毒（4）操作2.污染的鉴别（1）细菌、真菌污染的检测（2）支原体污染的检测（三）污染的清除和预防

污染的清除（1）使用抗生素（2）加温处理2.污染的预防（1）从物品、用品消毒灭菌着手（2）从操作者做起（3）防止细胞交叉污染

四、细胞的冻存与复苏技术

一、细胞的冻存

细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而导致细胞死亡。采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。

慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

1、细胞冻存方法（1）选择处于对数生长期的细胞，去细胞培养液，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化。将细胞收集于离心管中离心。离心后弃上清液，加含血清的培养基重悬细胞。（2）取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率。细胞浓度为1～10×106/mL之间。加入冻存管，约1ml/管。（3）将冷冻管盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。（4）将冻存管置入4℃冰箱中30分钟，再移至－20℃冰箱30分钟，－70℃冰箱2小时或过夜，最后放