(1.4.1.8)-生化实验十三 Km值测定

实验项目十三

Km值测定教学目的： 一、掌握Km值的定义和意义，掌握可调式移液器的使用方法。

二、熟悉林-贝氏双倒数法测定Km及Vmax值的过程。

三、了解实验设计的思路，优缺点。

原理： 当温度、pH等条件恒定时，酶促反应速度V随底物浓度[S]增大而增大，二者关系符合米氏方程。

V=

Vmax[S]

Km+[S]原理：

Km的值相当于酶促反应为最大速度一半时的底物浓度。是酶的特征性常数。用米氏方程作图求Km不方便，将方程双侧取倒数，即得到直线方程（林-贝氏作图法）。

1Km11

VVmax[S]Vmax=.+原理：1V1S1Km1Vmax原理： 酵母蔗糖酶Km的测定：

蔗糖酶分解蔗糖为葡萄糖和果糖，分解产物与碱性铜盐共热，在碱性条件下，Cu2+被还原为Cu2O，Cu2O再还原砷钼酸试剂生成钼蓝，钼蓝颜色的深浅与生成还原性糖的量成正比，通过比色分析，可求得酶促反应速度。原理：

Cu2+————Cu2O

Mo+6————

Mo+5----+2(蓝色)葡萄糖和果糖还原操作步骤

取13支试管，编号：12345678910111213缓冲溶液0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2--蔗糖-0.10.20.30.40.50.10.20.30.40.5--水0.60.50.40.30.20.10.50.40.30.20.11.00.8碱性铜盐1.01.01.01.01.01.01.0混匀各管，30度保温5min后，1~6管间隔准确1分钟加保温的酶液酶0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2--1号管30度保温10分钟后，加碱性铜盐终止反应，间隔准确1分钟终止1~6管标准葡糖------------0.2操作步骤

将13支试管同置沸水浴中加热20分钟后，冷却，每管加砷钼酸试剂1mL，摇匀后，放置5分钟，各加蒸馏水7mL，用塑料膜压住管口，颠倒混匀，660nm比色分析：

以1号管为酶空白测定2-11号管吸光度

以12号管为水空白测定13号管吸光度计算一、计算各管反应中所产生的还原糖的微量摩尔数。

二、按林-贝氏作图法以各管的实际蔗糖浓度的倒数作横坐标即1/[S]，以各管每分钟产生的还原糖的微摩尔数的倒数为纵坐标即1/V，绘制直线

三、求出Km及Vmax结果（供参考）

2：0.122

3：0.244

4：0.335

5：0.475

6：0.658

7：0.008

8：0.016

9：0.024

10：0.089

11：0.189

13：0.250

2-7：0.114

3-8：0.228

4-9：0.311

5-10：0.386

6-11：0.469

结果（供参考）

2-7：0.114

3-8：0.228

4-9：0.311

5-10：0.386

6-11：0.469

13：0.250

2号管：[S]=0.01M

3号管：[S]=0.02M

4号管：[S]=0.03M

5号管：[S]=0.04M

6号管：[S]=0.05M

结果（供参考）

2-7：0.114

3-8：0.228

4-9：0.311

5-10：0.386

6-11：0.469

13：0.250

2号管：1/[S]=100L/mol

3号管：1/[S]=50L/mol

4号管：1/[S]=33.3L/mol

5号管：1/[S]=25L/mol

6号管：1/[S]=20L/mol

以此值为横坐标结果（供参考）

2-7：0.114

3-8：0.228

4-9：0.311

5-10：0.386

6-11：0.469

13：0.250

2号管：V=0.114/0.250*1*400*0.1

=18.24μmol/min.mL

3号管：V=36.48μmol/min.mL

4号管：V=49.76μmol/min.mL

5号管：V=61.76μmol/min.mL

6号管：V=70.54μmol/min.mL

以此值倒数为纵坐标结果（供参考）

2号管：1/V=0.054825

3号管：1/V=0.027412

4号管：1/V=0.020096

5号管：1/V=0.016192

6号管：1/V=0.013326

min.mL/μmol

以此值为纵坐标2号管：1/[S]=100L/mol

3号管：