GBT 34550.3-2017 海水冷却水处理药剂性能评价方法 第3部分：菌藻抑制性能的测定

海水冷却水处理药剂性能评价方法第3部分：菌藻抑制性能的测定2017-09-29发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布GB/T34550.3—2017前言 I 2规范性引用文件 3术语和定义 14方法原理 25试剂和材料 26仪器与设备 27采样 38试样的制备和分装 49试样的杀菌处理 410结果计算 511质量保证与控制 5附录A(规范性附录)f/2培养基 6附录B(规范性附录)部分菌藻抑制剂的常用中和剂 8附录C(规范性附录)试样的增菌培养方法 9参考文献 IGB/T34550《海水冷却水处理药剂性能评价方法》分为四个部分：——第1部分：缓蚀性能的测定；——第2部分：阻垢性能的测定；——第3部分：菌藻抑制性能的测定；本部分为GB/T34550的第3部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家海洋局提出。本部分由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本部分起草单位：国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所、浙江国华浙能发电有限公司。1海水冷却水处理药剂性能评价方法第3部分：菌藻抑制性能的测定GB/T34550的本部分规定了海水冷却水处理药剂菌藻抑制性能的测定方法。本部分适用于海水冷却水处理药剂菌藻抑制性能的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T12763.6—2007海洋调查规范第6部分：海洋生物调查GB17378.7—2007海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查和生物监测HY/T176—2014海水中铁细菌的测定MPN法HY/T177—2014海水中硫酸盐还原菌的测定MPN法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。海水冷却水处理药剂coolingseawatertreatmentagent海水冷却水处理过程中所使用的化学品。注：一般包括海水缓蚀剂、阻垢分散剂、菌藻抑制剂等。菌藻抑制剂microbicide抑制或杀死细菌营养细胞、真菌营养细胞和孢子、单细胞藻类和原生动物的化学品。生物膜biofilm微生物在冷却系统内部固液界面的固体表面生长繁殖而形成的薄膜。微生物粘泥microbialbiofouling微生物及其分泌的粘液与其他有机和无机的杂质混合在一起的粘浊物质。陈海水agedseawater取天然海水避光保存3个月以上，使用时取其清液或经0.45μm滤膜过滤的滤液。2在固体培养基表面或内部由单个微生物细胞或孢子繁殖形成的肉眼可见的细胞群体。菌落形成单位colony-formingunit;CFU采用平皿计数法测定的菌落数量。4方法原理向海水冷却水样中，定量投加待测菌藻抑制剂，作用一定时间后，测定水样中的微生物量，并与水样中的初始微生物量进行比较，以确定菌藻抑制剂的最低有效浓度。5试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和GB/T6682规定的三级水。5.4细菌培养基：异养菌培养基选用2216E培养基，可按照GB/T12763.6—2007的6.3.2.1.3方法配制；铁细菌培养基按照HY/T176—2014的7.1方法配制；硫酸盐还原菌培养基按照HY/T177—2014的7.2方法配制。5.5真菌培养基：庆大霉素马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),可按照GB/T12763.6—2007的6.3.2.1.5方法配制5.6藻类培养基：f/2培养基，配方及配制方法见附录A。5.7陈海水。5.8人工海水：将31.8gNaCl、7.74gMgSO₄、6.0gMgCl₂、1.53gCaCl₂、0.07gKCl和2.0gNaHCO₃加入到1000mL水中，混匀后备用。5.9无菌稀释水：将陈海水或人工海水，分装到玻璃瓶(6.14)或试管(6.16)中，分装体积99mL±2mL或9mL±1mL。经蒸汽压力灭菌器(6.4)在121℃±1℃下灭菌20min,冷却后备用。5.10菌藻抑制剂：应选择稀释剂(5.1)稀释，稀释成浓度为5.0mg/mL和0.5mg/mL的贮备液，现配现用。5.11微孔滤膜：醋酸纤维或硝化纤维材质，直径50mm,孔径0.22μm、0.45μm和0.65μm。使用前需浸泡于蒸馏水中，经蒸汽压力灭菌器(6.4)在121℃±1℃下灭菌20min,冷却后备用。5.13医用注射器：聚丙烯塑料或硅硼铝玻璃材质，容量1mL～100mL,与针式过滤器(5.12)配套使用。6仪器与设备6.1天平：称量范围0～200g,感量0.01g。6.2菌落计数仪。6.3恒温振荡器：恒温范围(25℃~70℃)±0.2℃,振荡频率50r/min～220r/min。6.4蒸汽压力灭菌器：(110℃~126℃)±1℃。36.5电热干燥箱：温度控制范围(50℃~300℃)±2℃。6.6磁力搅拌器或电动搅拌器。6.7无菌箱(室)或超净工作台。6.8恒温培养箱：(20℃~60℃)±1℃。6.9电热恒温水浴锅：恒温范围(37℃~100℃)±1℃。6.10冰箱。6.11无油真空泵。6.13烧杯：1000mL。带螺旋盖。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却备用。配硅胶塞。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~6.16试管：直径18mm,长度180mm,配硅胶塞或试管帽。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却备用。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却备用。6.18刻度吸管或移液器和枪头：20μL～200μL、200μL～100器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却备用。6.19刮刀：耐高温硅胶。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却备用。6.20采样瓶：2000mL～5000mL广口玻璃瓶或聚丙烯塑料瓶。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却备用。聚乙烯塑料袋，可蒸汽灭菌。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却备用。6.22溶剂过滤器：玻璃或316L卫生级不锈钢材质，直径47mm过滤基座，300mL～500mL滤杯，1000mL～2000mL滤瓶，与50mm直径微孔滤膜配套使用。经蒸汽压力灭菌器121℃±1℃灭菌20min后，50℃~60℃烘干冷却备用。6.24漩涡混匀器。6.25相差或暗视野显微镜：放大倍数400～1000。6.26试管架。7采样7.1海水冷却水的采集7.1.1采样前应先测定冷却塔集水池的水温和pH,并做记录。7.1.2用采样瓶(6.20)直接从单塔海水冷却水系统中选取至少3个采样点，或从多塔海水冷却水系统的每个冷却塔相同位置选取至少1个采样点，分别采集2L～5L海水冷却水。7.1.3在海水冷却水系统停加菌藻抑制剂4h后采样，并将采集到的海水冷却水混合，作为样品A,待测。若需在停加菌藻抑制剂4h内采样，则在采集海水冷却水后立即加入一种菌藻抑制剂的中和剂(或在采样前向采样瓶中预先加入一种菌藻抑制剂的中和剂),然后混合，作为样品A,待测。中和剂的选择4见附录B。7.1.4在运输中应将样品A保存在集水池水温±5℃。如果在采样和实验时样品A的pH值出现±1.0的波动，实验水样应被丢弃。采样后应在24h内开始实验。7.2海水冷却系统生物膜或微生物黏泥的采集7.2.1用刮刀(6.19)从单塔海水冷却水系统中选取至少3个附着菌藻的区域，或从多塔海水冷却水系统的每个冷却塔相同位置选取至少1个附着菌藻的区域，分别采集约100g～500g生物膜或微生物黏7.2.2在运输中应将样品B保存在集水池水温±5℃。8试样的制备和分装8.1试样的制备8.1.1海水冷却水系统中的异养菌、铁细菌、硫酸盐还原菌、真菌和藻类均可作为评价海水冷却水处理剂菌藻抑制性能的代表菌。当采用异养菌、铁细菌或硫酸盐还原菌作为评价的代表菌时，试样初始含菌数应达到10⁵CFU/mL;当采用真菌或藻类作为评价的代表菌时，试样初始含菌数应达到10³CFU/mL。8.1.2若样品A的初始含菌量满足8.1.1的要求，可直接作为试样I使用；若样品A中的初始含菌量不能满足8.1.1的要求，应按附录C对样品A进行增菌培养以获得试样I。8.1.3按GB17378.7—2007的10.1测定样品A中异养菌的含量，按HY/T176—2014测定样品A中铁细菌的含量，按HY/T177—2014测定样品A中硫酸盐还原菌的含量，按GB/T12763.6—2007的8.1.4将样品B在无菌操作下，接种到过滤除菌或蒸汽灭菌的样品A中得到试样Ⅱ。样品B在试样Ⅱ中的接种量不得超过100g/L。8.2试样的分装8.2.1将试样I和试样Ⅱ放在搅拌器(6.6)上分别混匀后，再分别定量移取100mL±2mL(或100g±2g)试样I和试样Ⅱ到250mL玻璃瓶(6.14)或刻度锥形瓶(6.15)中。每一供试菌藻抑制剂浓度都应制备3个平行样。另外制备不加菌藻抑制剂的3个平行阴性对照样。8.2.2当使用溶剂而不是水来制备菌藻抑制剂的贮备液时，还应制备3个平行溶剂对照样，即将不含菌藻抑制剂的溶剂加入到试样I和试样Ⅱ中，溶剂的加入量应与投加菌藻抑制剂时引入的溶剂等量。8.2.3试样I和试样Ⅱ分装后，应测定阴性对照样的含菌量记为初始含菌量。9试样的杀菌处理9.1按1.5min～2.0min的时间间隔，依次向分装后的试样I和试样Ⅱ中投加菌藻抑制剂贮备液。每100mL试样中分别加入0.2mL、0.5mL和1.0mL菌藻抑制剂贮备液(5.10),每一菌藻抑制剂浓度均应制备3个平行样。9.2将投加菌藻抑制剂后的试样置于转速为100r/min的恒温振荡器(6.3)中混匀3min～5min,恒温振荡器的温度宜设定为采集样品时的集水池水温±5℃。9.3将混匀后的试样置于恒温培养箱(6.8)中，于集水池水温士5℃下静置培养3h±5min,取样测菌。9.4按8.1.3中所列的测菌方法测定试样含菌量。测菌前应使用合适的中和剂对试样中的菌藻抑制剂进行灭活处理。510结果计算10.1菌藻抑制性能以作用3h时的对数减少值R表示，按式(1)计算：R=logAlogB (1)A——空白样的初始微生物量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL);B——实验水样中的微生物量，单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)。R=1相当于90%的杀菌率；R=2相当于99%的杀菌率；R=3相当于99.9%的杀菌率；R=4相当于99.99%的杀菌率。10.2阴性和溶剂对照样(8.2.1,8.2.2)的初始微生物量在指定试验时间内的对数减少值若超过0.5log,则本次试验结果应被舍弃，并改变试验条件，重新实验。10.3报告结果取所有平行样的平均值。如果平行样的计数结果相差超过1个数量级，则应重做实验。10.4当R≥1时，表明菌藻抑制剂有效，并以达到R=1时的加药浓度作为最低有效浓度。11质量保证与控制11.1一般采用海水冷却水样制备试样，但当冷却水样不可得时，可采用陈海水(5.8)或配制人工海水11.2采集硫酸盐还原菌时采样瓶内要灌满海水冷却水。11.3若试样I和试样Ⅱ的初始细菌数少于10⁵CFU/mL、初始藻类或真菌数少于10³CFU/mL时，应按照8.1,向水样中接种细菌、藻类、真菌或生物膜达到要求。11.4菌藻抑制剂称量时，不应使用铝质称重盘，因为铝较活泼，易与菌藻抑制剂发生反应。11.5投加菌藻抑制剂时，菌藻抑制剂母液的加入量不得超过试样I和试样Ⅱ分装后体积的1%,特别是在用溶剂而不是用水来制备菌藻抑制剂贮备液时。11.6试样I和试样Ⅱ经菌藻抑制剂处理后，若R<1时，应调整菌藻抑制剂的投加浓度。11.7以叶绿素的含量来计量藻生物量时，应确定本底值。6(规范性附录)f/2培养基A.1.1微量元素贮备液A.1.1.1成分成分如下(每升中的含量):b)FeCl₃·6H₂O3150mg;d)ZnSO₄·7H₂O22g)Na₂Mo₄·2H₂OA.1.1.2制法将上述各成分溶于1L水中，混匀，制得微量元素贮备液。A.1.2复合维生素贮备液A.1.2.1成分成分如下(每升中的含量):a)氰钴维生素(维生素Bi₂)0.5mg;b)硫胺素(维生素B₁)100mg;c)生物素(维生素H)0.5mg。A.1.2.2制法将上述各成分溶于1L水中，匀，贮oA.2培养基的制备成分如下(每升中的含量):b)NaH₂PO₄·2H₂Oc)微量元素贮备液d)复合维生素贮备液7A.2.2制法将上述各成分移入1L陈海水(5.7)中，混匀。用氢氧化钠溶液(5.2)或盐酸溶液(5.3)调节培养基的pH值至8.0,并分装于刻度锥形瓶(6.15)中，用蒸汽压力灭菌器(121℃±1℃)灭菌20min,冷却后8(规范性附录)部分菌藻抑制剂的常用中和剂部分菌藻抑制剂的常用中和剂见表B.1。菌藻抑制剂中和剂含氯(碘)消毒剂(有效氯或碘0.1%～0.5%)硫代硫酸钠(0.1%～1.0%)过氧乙酸溶液(0.1%～0.5%)硫代硫酸钠(0.1%～0.5%)过氧化氢溶液(1.0%～3.0%)硫代硫酸钠(0.5%～1.0%)甲醛溶液(1%)1)1%双甲酮与0.6%吗啉混合液2)0.1%～0.5%亚硫酸钠戊二醛溶液(2%)1%甘氨酸或1%甲醛季铵盐消毒剂(0.1%～0.5%)吐温-80(0.5%～3.0%)+卵磷脂(1%～2%)酚类消毒剂吐温-80(0.5%～3.0%)复方消毒剂吐温-80(1%)+卵磷脂(1%)+硫代硫酸钠(0.5%)9(规范性附录)试样的增菌培养方法C.1异养菌的增菌培养方法C.1.1配制液体培养基将5.0g蛋白胨、1.0g酵母膏和0.1g磷酸高铁加入到1000mL陈海水(5.7)或人工海水(5.8)中，混匀。用氢氧化钠溶液(5.2)或盐酸溶液(5.3)调节pH值至7.6±0.2,并分装于刻度锥形瓶(6.15)中，于121℃±1℃下蒸汽压力灭菌20min,冷却后备用。C.1.2富集菌种的制备取1mL样品A(7.1.2),接种到100mL液体培养基(C.1.1)中，在采集样品时的集水池水温±5℃下培养48h～72h,得到异养菌富集菌种。C.1.3试样I的制备将富集菌种(C.1.2)在无菌操作下，接种到经0.22μm滤膜过滤除菌或121℃±1℃下蒸汽灭菌20min的样品A中，得到试样I。富集菌种在试样I中的接种量不得超过100mL/L,且接种后的试样I中异养菌的含菌量控制在10⁵CFU/mL数量级。C.2铁细菌的增菌培养方法C.2.1配制浓缩培养基按照HY/T176—201430min,冷却后备用。的7.1方法配制1.5倍浓缩液体培养基，于110℃±1℃下蒸汽压力灭菌C.2.2富集菌种的制备取33mL样品A(7.1.2),接种到67mL液体培养基(C.2.1)中，在采集样品时的集水池水温±5℃下培养48h～72h,得到铁细菌富集菌种。将富集菌种(C.2.2)在无菌操作下，接种到经0.22μm滤膜过滤除菌或121℃±1℃下蒸汽灭菌20min的样品A中，得到试样I。富集菌种在试样I中的接种量不得超过100mL/L,且接种后的试样I中铁细菌的含菌量控制在10⁵CFU/mL数量级。C.3硫酸盐还原菌的增菌培养方法C.3.1配制浓缩培养基按照HY/T177—201430min,冷却后备用。的7.2方法配制1.5倍浓缩液体培养基，于110℃±1℃下蒸汽压力灭菌C.3.2富集菌种的制备取33mL样品A(7.1.2),接种到67mL液体培养基(C.3.1)中，在采集样品时的集水池水温±5℃下培养48h～72h,得到硫酸盐还原菌富集菌种。C.3.3试样I的制备将富集菌种(C.3.2)在无菌操作下，接种到经0.22μm滤膜过滤除菌或121℃±1℃下蒸汽灭菌2