HYT 176-2014 海水中铁细菌的测定 MPN法

海水中铁细菌的测定MPN法Determinationofiron发布I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所提出。本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本标准由国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所、浙江国华浙能发电有限公司负责起草。1海水中铁细菌的测定MPN法本标准规定了海水中铁细菌的MPN测定方法。本标准适用于海水及海水利用浓海水中铁细菌的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T16310.1—1996船舶散装运输液体化学品危害性评价规范水生生物急性毒性试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。铁细菌ironbacteria一类能将溶于水中的棕色亚铁离子转变为不溶于水的褐色或黑色三氧化二铁水合物的细菌。应用多管发酵技术，采用概率理论估算细菌浓度的方法。取自未污染海域，装入玻璃瓶后储放在暗处15d以上的海水。4方法原理本方法采用多管发酵技术，在(29±1)℃培养14d,如果试管中棕色消失而且形成褐色或黑色沉淀，表明阳性反应，采用MPN法对被测试样中的铁细菌进行计数。5试剂与材料本试验方法中，除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB/T试验所需试剂与材料如下：6682中三级水规格的水。a)硫酸镁；b)硫酸铵；c)磷酸氢二钾；d)无水氯化钙，2e)硝酸钠；f)柠檬酸铁铵；g)硫代硫酸钠；h)陈海水；配制；i)人工海水：按GB/T16310.1—1996配制；j)氢氧化钠溶液：160g/L;k)盐酸溶液：1+11;1)牛皮纸。6仪器与设备6.1无菌箱(室)或超净工作台。6.2蒸汽压力灭菌器。6.3生化培养箱：(29±1)℃。6.4电热干燥箱：温度控制范围60℃~280℃,允差±2℃。6.5电热恒温水浴锅：恒温范围37℃~100℃,允差±1℃。6.6天平：称量范围0g～220g,感量0.01g。6.7冰箱。6.8振荡器。6.9刻度吸管或移液器：1mL、10mL。6.11烧杯：1000mL。6.12无菌试管：直径18mm,长度180mm,配硅胶塞。6.13无菌刻度吸管或移液器和Tip头。6.14无菌采样瓶：广口玻璃瓶或聚丙烯(PP)塑料瓶。6.15试管架。6.16pH计或精密pH试纸(6.4～8.0)。7试验前准备7.1培养基的配置成分如下(每升中的含量):a)硫酸镁b)硫酸铵c)磷酸氢二钾d)无水氯化钙e)硝酸钠f)柠檬酸铁铵3将7.1.1a)～f)试剂溶解到500mL海水和500mL蒸馏水配制的混合水中，用氢氧化钠溶液(160g/L)或盐酸溶液(1+11)调节pH至6.8±0.2,并分装在试管(6.12)中，每管5mL～10mL,用蒸汽压力灭菌器(110±1)℃灭菌30min,冷却后备用。7.2无菌稀释水的制备将陈海水或人工海水分装在试管(6.12)中，每管9mL,用蒸汽压力灭菌器(121±1)℃灭菌20min,冷却后备用。7.3硫代硫酸钠将硫代硫酸钠放在无菌箱(室)(6.1)内，并均匀地摊放在离紫外线灯的垂直距离30cm处灭菌30min备用。8分析检测8.1水样的采集8.1.1用灭菌采样瓶(6.14)采集被测样品，在采样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部位受杂菌污染，瓶内要留有足够的空间，以备测定之前摇匀。8.1.2若采集的水样中有余氯，或在不能判断水样中是否有余氯的情况下，应在采样前，在无菌操作下，于灭菌采样瓶(6.14)中加入硫代硫酸钠(7.3),加入量为每升水样约0.1g。若确定水样不含余氯，则无需加入硫代硫酸钠(7.3)。8.1.3水样采集后，应立即进行测定，如果在2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中冷藏保存，存放时间不宜超过24h。经冷藏保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，在生化培养箱(6.3)中(29±1)℃活化4h～5h,再进行测定。8.2水样的稀释和接种8.2.1按10倍稀释法对水样进行系列稀释，应使最后一个稀释度接种培养后无铁细菌生长。8.2.2将不同稀释度的水样分别接种到已灭菌的装有培养基的试管(7.1.2)中，每个稀释度重复接种3～5管，每管接种1mL,每接种一个稀释度更换一支无菌吸管或Tip头(6.13)。8.2.3另取一组已灭菌的装有培养基的试管(7.1.2),接种1mL无菌稀释水作为空白对照。在生化培养箱(6.3)中，于(29±1)℃培养14d。9计数与报告9.1如果试管中产生褐色或黑色沉淀且原培养基中棕色消失变为透明状，表明有铁细菌存在，以“+”9.2如果空白对照出现阳性反应，表明测定过程中有污染，本次测定无效。9.3数出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来。9.4在10进位稀释中多于三个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度。以每个4稀释度接种5管为例，对这三个稀释度的决定是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出与其相连的两个更高的稀释度，算出阳性组合指数(见表1例1、例2、例4)。9.5若依照9.4所规定的原则选出三个稀释度后，有更高的稀释度仍然产生一个阳性试管时，就应该将这一个阳性试管并入所选择的最高稀释度的阳性结果中(见表1例3)。9.6根据阳性组合的指数，查附录A得出最大可能菌数，除以阳性组合指数的第一位数字的稀释度数，即为每毫升水样中铁细菌的菌数(如果每个稀释度重复接种4管或3管，根据阳性组合的指数查附录B或附录C)。9.7报告方式见表1。表1计数与报告方式阳性组(个/mL)1552002420053045