微生物课件：第三章 微生物的营养与生长

第三章微生物的营养与生长

从生物学的观点来看，微生物活细胞是个新陈代谢的动力系统，它从环境不断地吸收营养物质，通过新陈代谢，实现生长和繁殖，同时排出“废物”。笫一节微生物的营养•

营养物质nutriment：微生物在生命活动中

从环境中吸取的用以提供能量、调节新陈

代谢以及合成细胞物质的物质。在发酵工

业上也包括用于合成产物。•

营养过程nutrition：微生物吸收和利用营

养物质的过程。碳源

carbon

source凡是能被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。能源

energy

source•

能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物质或辐射能。分类标准营养类型能源光能营养型phototroph以光能为能源化能营养型chemotroph以有机物为能源碳源自养型autotroph以CO2为唯一或主要碳源异养型heterotroph以有机物为碳源一、微生物的营养类型(一)、微生物营养类型的分类分类标准营养类型氢供体无机营养型lithotroph有机营养型organotroph生长因子原养型(prototroph)/野生型(wildtype)营养缺陷型auxotroph合成氨基酸能力氨基酸自养型aminoacidautotroph氨基酸异养型aminoacidheterotroph取食方式渗透营养型osmotroph吞噬营养型phagotroph取得死或活有机物腐生saproghytism寄生parasitism(二)、微生物的营养类型1.

光能无机营养型

photolithotroph能源：光主要碳源：CO2供氢体：H2S、Na2S2O3例：绿硫细菌，紫硫细菌CO2+H2S

[CH2O]+2S+H2O细菌叶绿素2.

光能有机营养型

photoorganotroph

能源：光；

主要碳源：有机物，但可以将CO2还原成细胞物质;

供氢体：有机物例：2CH3CHOHCH3+CO22CH3COCH3+[CH2O]+H2O红螺细菌

光合色素

3.化能无机营养型

chemolithotroph•

能源：无机物，NH3，NO2，

H2，H2S，S等主要碳源：CO2

电子供体：无机物例：

氧化亚铁硫杆菌Fe+2Fe+3

+

e

+

11.3千卡4.化能有机营养型

chemoorganotroph能源：有机物主要碳源：有机物例：大部分种类的微生物，工业用菌种多为此类营养类型的划分不是绝对的，在自然界中存在中间类型。营养类型的划分以最简单的营养条件为依据，并以“严格”,“兼性”加以区分。营养类型能源氢供体基本碳源实例光能无机营养型（光能自养型）光无机物CO2紫硫细菌、绿硫细菌、藻类光能有机营养型（光能异养型）光有机物CO及简单2有机物红螺细菌化能无机营养型（化能自养型）无机物无机物CO2硝化细菌、硫化细菌化能有机营养型（化能异养型）有机物有机物有机物绝大多数细菌和全部真核微生物微生物的营养类型二.

微生物的营养物质(一)、微生物细胞的化学组成1、元素组成：C、H、O、N、P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo。其中C、H、O、N、P占细胞干重的97%。2、物质组成水：约占细胞湿重的90%。有机物：主要有蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸、维生素以及它们的合成中间体和降解物。无机盐：灰分元素是指参与有机物组成及单独存在于细胞原生质内的无机盐等灰分物质中的元素。3．影响微生物细胞化学组成的因素微生物的种类：硫细菌、铁细菌、海洋细菌含有较多的S、Fe、Cl和Na。菌龄：幼龄菌中含氮量较高。培养条件：在氮源丰富的环境中生长的微生物含氮量较高。微生物细胞元素组成(二)重要营养物质的作用

1、水

水的生理功能••••细胞的重要组分微生物进行代谢活动的介质参与部分生化反应调节和控制细胞温度几种生物的游离水含量人：

~60%海蛰：~96%微生物：孢子：霉菌孢子：~39%细菌芽孢：皮层：~70%核心：极低营养体：细菌：~80%酵母：~75%霉菌：~85%环境中水的存在状态•

结合水：与溶质或其它分子结合而不能被微生物所利用状态的水；•

游离水：可以被微生物所利用的水水活度water

activity：在相同温度、压力条件下，溶液中水的蒸汽压（P）、纯水蒸汽压（P0）aw=

p/p0纯水的aw为1．00，当纯水中溶有溶质后，aw＜1.00。微生物生长要求：aw=0.63~0.992.碳源

carbon

source凡是能被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。生理功能

提供C元素

提供能量碳源物质有机碳化物无机碳化物类型元素水平化合物水平培养基原料水平有机碳C·H·O·N·X复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、蛋白胨、豆饼粉等C·H·O·N多数氨基酸、简单蛋白质等一般氨基酸、明胶等C·H·O糖、有机酸、醇、脂类等葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、糖蜜等C·H烃类天然气、石油及其不同馏分、石蜡油等无机碳C(?)------C·OC02CO2C·O·N·NaCO、CaCO等33NaCO、CaCO、白垩等33微生物的碳源谱3.氮源

nitrogen

source•

凡是能被微生物用来构成细胞物质

或代谢产物中氮素来源的营养物质

称为氮源•是构成细胞中核酸和蛋白质的重要元素，只为少数细菌提供能量类型元素水平化合物水平培养基原料水平有机氮N·C·H·O·X复杂蛋白质、核酸等蚕蛹等N·C·H·O尿素、多数氨基酸、简单蛋白质等尿素、蛋白胨、明胶等无机氮N·HNH、铵盐等3（NH）SO等424N·O硝酸盐等KNO等3NN2空气微生物的氮源谱牛肉膏、酵母膏、豆饼粉、氮源的种类无机氮、有机氮、气体氮速效性氮源能够被微生物细胞直接吸收和利用的有机氮源。迟效性氮源不能被微生物直接吸收，必须先经相应的水解酶降解以后，才能被细胞吸收利用的有机氮源“生理酸性盐”与“生理碱性盐”•

生理酸性盐由于其阳离子中的氮被微生物选择性吸收利用而造成培养基的pH下降的盐。如(NH4)2SO4•

生理碱性盐由于其阴离子中的氮被微生物选择性吸收利用而造成培养基的pH上升的盐。如NaNO34.无机盐类mineral

salts•

生理功能参与细胞结构物质的组成；参与酶的组成及调节酶的活性；参与能量转移；调节并维持细胞渗透压的平衡；作为某些微生物的能源物质•

大量（主要/宏量）元素

macroelementsP、S、K、Na、Ca、Mg等需要量：10-3~10-4M•

微量元素

microelementsFe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo等需要量：

10-6~10-8M锌乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、RNA聚合酶等锰过氧化物歧化酶、磷酸烯醇式脱羧酶等钼硝酸盐还原酶、固氮酶等铜细胞色素氧化酶硒甘氨酸还原酶、甲酸脱氢酶微量元素的生理功能（举例）无机盐一般采用的浓度范围5.生长因子

growth

factor

是指微生物生长不可缺少的微量有机物质.•种类

维生素、氨基酸、碱基•

需要量

维生素：1—50ug/L

氨基酸：20—50ug/L

碱

基：10—20ug/L

核苷或核苷酸：200—2000ug/L•

向培养基中添加生长因子的措施直接添加添加富含生长因子的物质酵母膏，玉米浆，肝浸汁，麦芽汁几种微生物的生长因子

菌种丙酮丁醇梭菌德氏乳杆菌干酪乳杆菌粪链球菌肠膜明串珠菌金黄色葡萄球菌

生长因子对氨基苯甲酸酪氨酸、胸腺核苷

生物素、麻黄素

叶酸、精氨酸

吡哆醛

硫胺素玉米浆含的氨基酸6、能源

energy

source•

能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物质或辐射能。•

能源谱化学物质：有机物、无机物辐射能

7、气体

（1）氧O2

：•

微生物的对氧的需求

专性好氧菌：只能在有氧的环境中生长

专性厌氧菌：只能在无氧的环境中生长

兼性厌氧菌：在有氧及无氧的环境中都能生长微嗜氧菌：只能在氧分压很低的环境中生长•

向微生物提供氧的措施实验室：液体培养（三角瓶、试管）：浅液层、振荡固体培养（平板、斜面）：表面生长大生产：液体培养（发酵罐）：通风、搅拌固体培养：浅层、通风Pi

ADP

COOH

HOOCCOCH

ATP

CO

COCOOH

CH

2

2

3

+

+

⎯

⎯

⎯

⎯

→

⎯

+

+

丙酮

羧（2）二氧化碳CO2•

对于自养微生物：唯一或主要碳源•

对于异养微生物：辅助碳源酸

化酶四.营养物质的跨膜输送

微生物是通过细胞膜的渗透和选择吸收作用而从外界吸取营养物质的。被动吸收——简单扩散和促进扩散主动吸收——主动运输、基团移位和ATP结合性盒式转运蛋白系统原生动物——膜泡运输本部分要求掌握①输送动力，②输送方向，③是否需要载体及其特异性，④被输送物质在输送过程中是否发生化学变化⑤输送物质举例。（一）被动扩散1.简单扩散

simple

diffusion•

无载体蛋白参与下，单纯依靠物理扩散方式输送营养物质。•

特点输送动力：浓度梯度输送方向：顺浓度梯度输送物质：水、气体、脂溶性物质、极性小的分子过程：进入膜的疏水脂质区域；通过脂质双分子层；离开脂相回到水相（细胞内）。输送机制：通过亲水小孔或脂双分子层。J=D

dc/dx

J：扩散速度D：扩散系数dc/dx：该物质的浓度梯度•

影响因素分子的大小、溶解性、极性和环境的温度等

2、促进扩散

facilitated

diffusion•

在特异性载体蛋白的协助下，不消耗能量的一类扩散性

运输方式。•

特点：输送动力：浓度梯度输送方向：顺浓度梯度载体蛋白：需要，具有特异性输送物质：极性大的分子（单糖、氨基酸、维生素、无机盐等输送机制：

载体外部疏水、接合部位亲水，被输送的物质与相应的载体

之间存在一种亲和力。（二）主动运输1、主动运输

active

transport•

在消耗能量的同时，实现溶质在细胞内的浓缩，而没有任何化学变化发生的输送机制。•

特点：输送动力：跨膜质子浓度梯度输送方向：逆浓度梯度载体蛋白：需要，具有特异性输送物质：氨基酸、某些糖、H+、Na+、K+等。输送机制：代谢能量改变底物与载体间的结合力。ATP结合性盒式转运蛋白系统（

ATP-binding

cassette

transpoter

ABC运输系统）•

系统3个组成部分：周质结合蛋白，与被输送物质特异性结合跨膜输送蛋白，真正介导物质运输的ATP水解蛋白，为输送提供能量的•

主要存在于G-细菌中如大肠杆菌运输阿拉伯糖、麦芽糖、半乳糖及核糖、氨基酸（谷氨酸、组氨酸及亮氨酸）和维生素B12等溶质。2、基团移位

group

translocation••被输送的基质分子在膜内经受了共价的改变，以被修饰的形式进入细胞质的输送机制特点：输送动力：代谢能量,磷酸烯醇式丙酮酸上的高能磷酸键输送方向：逆浓度梯度载体蛋白：磷酸转移酶系统输送物质：E.coli对Glucose等的吸收，被输送物质在输送前后的存在状态：在细胞膜内被磷酸化输送机制：存在特殊输送系统•输送机制：磷酸转移酶系统（PTS）酶Ⅰ：非特异性，存在于细胞质中酶Ⅱc：特异性(诱导型)，存在于膜上因子Ⅲ(酶Ⅱa/b)：特异性，存在于细胞质中HPr(组氨酸蛋白质/热稳定蛋白质)：非特异性，存在于细胞质中四种物质运输方式的比较(三)膜泡运输

Membrane

vesicle

transport

通过趋化性运动靠近营养物质，将它吸附到膜表面，形成膜泡，并进入细胞质。•

胞吞作用•

胞饮作用五、培养基

medium人工配制的含有营养物质的供微生物生长繁殖或积累代谢产物的基质（一）培养基应具有的共性单位数量的培养基应能以最高产率地生产出所需产物，能最高速率地稳定合成出所需产物，培养基成分应价格便宜易于就近取材，

培养基有利于通风、搅拌、提取、纯化和废物处理等（二）培养基的种类1、按对培养基成分的了解分类天然培养基

complex

medium；undefined

medium

利用化学成分还不清楚

或不恒定的天然有机物质制成的培养基。如：实验室用的麦汁培养基马铃薯浸汁培养基大生产用山芋干粉糖化醪一些营养物质的来源与成分合成培养基synthetic

medium，defined

medium利用化学成分完全了解的高纯化学试剂制成的培养基。如：培养霉菌用的察氏培养基（g/L)NaNO3

2,

K2HPO4

1,

KCl

0.5,

MgSO4·7H2O

0.5FeSO4·7H2O

0.01,

蔗糖

30,

琼脂

20,

pH

自然•

半合成培养基semi-

synthetic

medium由部分天然有机物和部分化学试剂制成的培养基。如：LB培养基(g/L)：Tryptone

10,

Yeast

Extract

5,

NaCl

10,

pH7.22、据培养基的物理状态分类•

液体培养基

liquid

medium呈液体状态的培养基•

固体培养基solid

medium外观呈固体状态的培养基•

半固体培养基semi-solid

medium

呈当容器倒放时不致流下、但在剧烈振荡后则能破散状态的凝固性固体培养基。琼脂的加量为0.5%左右。固体培养基①凝固培养基（solidified

medium）：遇热可融化、冷却后则凝固的培养基。②非可逆性凝固培养基：当凝固后就不能再融化的固体培养基。③天然固体培养基：由天然固体物质直接制成的固体培养基。④滤膜（membrane

filter）：是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维素薄膜。琼脂和明胶的区别比较内容常用浓度熔点℃凝固点℃PH灰分

%CaO

%MgO

%氮

%微生物的可利用能力琼脂1.5-2.0%98-10040-42微酸161.150.770.4绝大多数微生物不能利用明胶5-12%2520酸性14-150018.3不少微生物能利用3、按照培养基的特殊用途分类（1）加富培养基

enriched

medium为分离某种微生物而专门设计，

加入了助长该类微生物的营养物质的培养基。（2）选择培养基

selected

medium加入特殊的营养物质助长某类目的微生物;或添加某种化学物质,以抑制不需要的菌的生长,从而促进目的菌生长的培养基。（3）鉴别培养基

differential

medium添加了某种试剂或化学药品而对特定的微生物起鉴别作用的培养基。一些鉴别培养基（4）种子培养基

seed

medium

培养发酵用的健壮的种子的培养基。（5）发酵培养基

fermentation

medium

用于合成某种预定的发酵的培养基。（6）繁殖和保藏培养基

细

菌：营养琼脂、LB培养基

放线菌：马铃薯培养基，高氏一号培养基

酵

母：麦汁培养基，YEPD培养基霉菌：麦汁培养基、察氏培养基(7)基础培养基几种相似培养基的共同部分例：Yeast

Carbon

Base-----酵母碳基

Yeast

Nitrogen

Base---酵母氮基Yeast

Nitrogen

Base

w/o

Amino

Acid

----无氨基酸酵母氮基培养基种类（三）制备培养基的要素（1）营养物质包括研究或实验微生物所需要的碳、氮、磷、硫等宏量元素及微量元素、生长因素及水等。在营养缺陷型（生长因素异养型）微生物的培养基中，必须配入所缺的生长因素。营养成分的溶解缓冲性组分；易沉淀组分；微量组分；合成培养基的组分（2）水活度：实际上是控制好培养基中可溶物质的浓度。（3）pH值：指灭菌后pH值，这与pH缓冲液和缓冲物（如CaCO3）的使用有关。（4）培养基的物理状态（5）灭菌方法第二节微生物的生长

生长：个体体积的增大及细胞原生质总量的增加。

繁殖：个体数量的增多。

群体生长：包含了个体生长和繁殖菌龄不是指个别细胞的菌龄，而是指细菌培养物在培养条件下渡过的时间一、微生物个体细胞的生长1、细菌的生长与繁殖二.

微生物生长的测定

(一)

直接计数法

1、显微计数法••酵母菌、霉菌孢子：血球计数器细菌：Petroff-Hausser或Helber计数器2、电子自动计数法Coulter电子计数器可测定细胞数、细胞大小分布。（二）间接计数法1、平板菌落计数法CFU：colony-forming

unit适用：单细胞或单孢子菌悬液方法：倾注平板、涂布平板2、薄膜过滤计数法微孔滤膜如硝化纤维素薄膜适用：量大、含菌浓度低的样品3、液体稀释法（或然率法）

MPN(

Most

probable

number)将样品作10倍系列稀释，定量接种液体培养基中(一般3个稀释度,每稀释度3、5管)，培养后记录出现生长的试管数，查MPN表。

应用：水中大肠菌群数测定

（三）其他方法1.测定细胞物质的量•

测定细胞干重法•

比浊法•

测定细胞总含氮量法

2..霉菌菌丝长度的测定••菌落直径测定法：U型管测定法：3.比色法（比浊法）•

600~700nm

波长•

原生质含量的增加，会引起培养物浑浊度的增高。•

注意：背景中无有色物质也无固体颗粒三.

微生物群体生长规律（一）细菌生长曲线

growth

curve

将少量细菌接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细胞密度（CFU），以活细胞数的对数对培养时间所作出的曲线称为生长曲线。细菌群体生长曲线1.延迟期（lag

phase调整期）••••活细胞数：基本不变细胞生理特点：分裂迟缓、代谢活跃出现的原因：调整代谢，适应新环境影响因素：菌种的遗传性；种龄；接种量；

培养基组分及培养条件•

缩短措施：2.对数期

log

phase/exponential

phase活细胞数：呈几何级数增加细胞的生理特点：细胞生长速率最大；细胞进行平衡生长；酶系活跃，代谢旺盛;繁殖代数和世代时间（G）x2=x1·2n繁殖代数n=(lg

x2-

lg

x1)/lg

2世代时间generation

timeG=lg

2

(t2-t1)/

(lg

x2-

lg

x1)在最适条件下几种微生物的世代时间

3、平衡期

stationary

phase1)

活细胞数：动态平衡2)3)

出现原因：

营养物质的消耗有生理毒性代谢产物的积累环境条件（pH,

氧化还原电位）的改变对细胞生长不利

细胞生理特点：分裂速度降低；活细胞数达到最大值；开始积累储藏物质；积累发酵产物；芽孢细菌产生芽孢4、衰亡期

decline

phase/death

phase•

活细胞数：逐渐下降•

细胞生理特点：细胞内颗粒更加明显，出现液泡细胞出现异常形态细胞死亡伴随自溶

（二）真菌的生长曲线1、酵母菌的生长曲线：与细菌相似2、丝状真菌的生长曲线

生长停滞期迅速生长期

衰退期

孢子萌发前的时期菌丝伸长及分枝菌丝体干重下降

伴随自溶（三）多种碳源及复合培养基存在下的微生物的生长•

葡萄糖和乳糖共存时大肠杆菌的二次生长曲线•

麦芽糖和蔗糖共存时酿酒酵母的二次生长曲线四.微生物的培养1.分批培养

batch

culture将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方法。•

摇瓶培养•

发酵罐培养2.补料分批培养

fed-batch

culture特点可以减弱底物或代谢产物的抑制增加次级代谢产物的产量可以提高发酵的细胞密度可以恒定培养条件方法阶段式补料连续补料----流加发酵3.连续培养

continuous

culture当微生物以分批培养的方式培养到对数期后，向培养器中不断补充新鲜营养物质，并以同样速度排出培养物，使微生物的增殖速度及培养基中的总菌量保持不变的培养方法。重要特征：微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态分批培养与连续培养的关系恒浊连续培养不断调节流速而使培养液的浊度(菌体密度)保持恒

定的连续培养方法•

反应器：恒浊器（turbidostat）•

目的：

不断提供具有一定生理状态的细胞，得到以最高

生长速率进行生长的培养物。•

应用：

获得大量的菌体

获得与菌体生长相平衡的代谢产物。恒化化连续培养

控制恒定的流速，使由于菌体生长而耗去的营养物及时得到补充；培养液中营养物浓度基本恒定，从而保持菌体的恒定生长速率的连续培养方法。•反应器：恒化器

chemostat•培养基：含一种限制性因子，其它营养成分均过量•

限制性因子条件菌体生长提供所必需的营养物质；

在一定的浓度范围内，生长速率与其浓度呈正比关系。•

限制因子的种类氨基酸，葡萄糖，生长因子，无机盐等连续培养处于稳定状态的条件•

D=F/V

=μF：培养基流入(流出)培养器的速度（

l/h）V：培养基中培养液的体积

(l)D：稀释率，单位时间内单位体积的培养基中流入流出的量（h-1)μ

：比生长速率，单位时间内单位重量的微生物所形成的新的菌体的重量(h-1)连续培养的稳定状态：D=F/V

=μ当D

=

μ

时，处于稳定状态当D＜

μ时，

μ减小，但培养物中细胞密度加大。当D＞

μ时，

μ增大，但培养物中细胞密度减小。当D＞

μ

max时，细胞被“洗出”，连续培养系统遭破坏酒精发酵(D=0.05-0.1)连续发酵的应用•连续发酵的优点

提高设备利用率

便于自动化控制

产品质量较稳定

节省人力、物力，水、电、气负荷均衡•

连续发酵的缺点

菌种易退化

易污染杂菌

营养物质利用率低于分批发酵五.同步培养物

synchronous

culture

Synchronous

culture

is

a

form

ofculture

on

which

all

the

cells

paththrough

the

same

stage

of

the

cellcycle

at

the

same

time。

在同一时刻，所有的细胞都处于细胞周期中的同一阶段的培养物叫同步培养物1、机械法依据：处于不同生长阶段的细胞的大小不同。•

密度梯度离心分离法•

过滤分离法（一）获得同步培养物的方法机械法•

优点：不打乱细胞原有的代谢•

缺点：2、调整生理条