反转录引物的选择与Real-TimePCR引物设计的要求

反转录引物的选择与Real-TimePCR引物设计的要求

1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2）Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。

3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

做RealTimePCR时，用于SYBRGreenI/EvaGreen法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

①Tm=55-65℃

②GC=30-80%

③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。

④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。

五、cDNA与引物质量检测

取0.2ml薄壁PCR管，编号。向各管中加入含染料2×PCRTaqMix10ul；加入正反向引物各0.5ul（引物浓度10uM），向管中加入混合的cDNA各1ul。各管补加水至20ul。组份加量2×PCRTaqMix10ul10uMPrimerFW0.5ul10uMPrimerRV0.5ulTemplateDNA1ulddH2O混匀至20ul

混匀，置于TP600PCR仪中。95℃5min；95℃15s，60℃35s，40cycles；72℃5min；4℃pause。

取扩增产物各8μl，DL2000分子量标准5μl/泳道。1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察。

选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。

六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：

由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。

七、定量PCR检测：

取0.2ml薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入2×qPCRTaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul。一管中不加模板用作阴性对照。各管补加水至25ul。组份加量模板(cDNA)/ddH2O1.0ul10uM引物F/R0.5ul2×qPCRMix12.5ulddH2O11.0ul

混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s（荧光检测），40cycles。荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。

八、扩增曲线和溶解曲线

溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。

如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质；

如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。

如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-TimePCR中很难避免；

若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。在溶解曲线中出现双峰有三种可能：

①引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物；

②在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰（只在引物跨内含子时存在），出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA；

③扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。九、表达差异的计算方法

绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。

2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。

在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。

2-△△CT方法的推导（详见实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量）

补充：在DNaseI消化样品RNA中的DNA后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：消化后总体积10Oul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加200ulDEPC水。1.

向离心管中加入等体积氯仿（约300ul），剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。4℃14000rpm离心8min，取上清（约250ul）。2.加入1/10体积的NaAC（3M）（约25ul）和预冷的等体积异丙醇（约280ul），-20℃放置20min。3.4℃14000rpm离心15min，去上清，注意不要触到沉淀。

4.

加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm离心3min，去上清。

5.

瞬时离心，用200ul（或10ul）的枪头小心吸去离心管底的残存液态（勿吸到管底的沉淀）。

6.把离心管放置于超净台晾至约5-10分钟（勿完全干燥，否则很难溶）。加入30~50μl的无RNase的水，静止1min后，振荡30sec，瞬时离心。7.

将提取的RNA立即进行下游实验，或放-20℃保存。Real-TimePCR的有5种主要类型的探测化学物质用于1内嵌染料（Sybr-GreenI）内嵌染料，例如Sybr-GreenI，能与双链DNA结合

a)SG不与单链DNA结合，荧光信号强度较低；

b)SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强。SG是一种荧光染料，能结合到DNA双螺旋的小沟。处于溶解状态的未结合染料显示低的荧光强度，一旦结合到双链DNA之后荧光信号增强。这种特性被利用在实时扩增中。由于在扩增反应中DNA增加，染料结合到扩增产物上，荧光信号增强。荧光信号相对背景水平的增加进行分析。根据扩增子的长度有多个荧光染料的分子结合到双链DNA上。内嵌染料可与所有其他传统扩增成分，例如水，缓冲液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到扩增反应管中。因为不需要设计序列特异性探针和新的引物对，这种方法是一种简便，性价比较高的实时监测方法。内嵌染料没有序列特异性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA上，因此有必要区分目标信号和假信号。内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，实时仪器连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰是凝胶电泳中条带的类似物。因此，用溶解曲线数据对SG反应后的产物进行质量监督。2双标记探针(如TaqManProbes)双标记探针是一种短的寡核苷酸序列，5‘末端连接有荧光报告染料，3‘端连接有荧光淬灭分子。由于这种探针只有15-25bp长，报告基团和淬灭基团紧密接近，几乎探测不到荧光信号。在循环过程中，TaqDNA聚合酶对每个引物进行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸过程中会切除下游的探针。一旦探针被降解，报告染料就会与淬灭分子相分离。

a)报告染料R发射的能量被淬灭分子Q所吸收和淬灭；

b)聚合酶的外切核酸酶活性通过水解方式将报告染料与淬灭分子相分离导致了荧光信号的增加。在每个扩增循环由于切开了探针因此实时设备探测到报告染料的增加。由于报告染料被切开，因此不能进行溶解曲线分析。双标记探针比内嵌染料有更高的特异性，有2个原因：首先，双标记探针具有序列特异性，只结合到互补区。第二个原因是双标记探针对每扩增的一个拷贝只释放一个分子的荧光染料。由于双标记探针增加了特异性，这种探测方法很适合检测低拷贝数的模板。3FRET探针FRET探针依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核苷酸序