医学免疫学实验课

医学免疫学实验课免疫学教研室李宗喜5346第一部分体液免疫实验实验一对流免疫电泳凝集实验动物免疫对流免疫电泳操作步骤1.打孔：用直径3mm的打孔器成对打孔，孔距为8-10mm。2.加样：用微量加样器将10μl（勿溢出）待检血清加在阴极（右侧）侧孔内，兔抗人IgG血清加到阳极（左侧）侧孔内。3.电泳2.5h。+-8mm兔抗人IgG血清待检血清左右注意事项打孔无裂缝孔勿靠近琼脂边缘加样不溢出加样无气泡清洗加样器要求准时白大衣认真记录爱惜实验室水、电、煤气名单课堂纪律两次试验报告期末考试免疫实验内容免疫应答体液免疫应答细胞免疫应答抗体的检测其它的抗原抗体反应血清抗体的检测抗体生成细胞的检测凝集反应沉淀反应腹腔巨噬细胞吞噬功能测定实验一、二、三实验四实验一

体液免疫试验流程动物免疫血清分离，细胞提取指标检测经典抗原抗体反应沉淀反应：对流免疫电泳凝集反应：ABO血型鉴定小鼠抗体水平的检测抗体生成细胞检测：溶血空斑试验血清中抗体水平的测定：ELISA抗原-抗体反应概念：体内外发生的高度特异性结合反应，其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗原结合位点的结构互补。特点：特异性非共价键结合比例要适当影响抗原-抗体反应的因素电解质：0.85%氯化钠温度：37℃酸碱度：pH6-8沉淀反应可溶性抗原（如细菌培养滤液、外毒素、血清蛋白等）与相应的抗体结合，在一定条件（适量的电解质，合适的酸碱度和温度）下，形成肉眼可见的沉淀现象，这个过程称为沉淀反应。反应中的抗原称为沉淀原(precipitinogen)，其相应抗体称为沉淀素(precipitin)。将抗体预先混入琼脂中，铺板，然后在板上打孔，孔中加入抗原。因为抗原能在琼脂中扩散，所以在抗原抗体比例适宜处形成白色沉淀环。环的直径与抗原量成正相关。单向免疫扩散结果分析183672144288NS火箭免疫电泳

当抗原和抗体加入含有适量电解质的琼脂凝胶的相邻的孔中，它们向四周扩散，若两者相互对应，分子比例适合，在扩散一定时间后在两孔之间相遇并结合生成白色沉淀线。双向免疫扩散结果分析AbAg沉淀线位置靠近浓度较小的一方沉淀线弯曲向分子量较大的一方一、对流免疫电泳对流免疫电泳试验是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。蛋白质抗原、抗体在电场中作定向加速度双向免疫扩散，从而加速沉淀线的形成。

实验原理在偏碱性的缓冲液和电场中，大部分抗原带负电荷，向阳极泳动；IgG等电点与缓冲液的pH接近，故极性基团解离很少，负电荷少；IgG分子量大，电渗作用使其缓慢向阴极移动。蛋白质是一种两性电解质,它同时具有游离氨基和羧基。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，静电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点（isoelectricpoint,pI）。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。等电点电渗作用电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼脂中含有SO42-，带负电荷，造成静电感应致使附近的水带正电荷，而向负极移动，所以电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更快。如果物质向正极移动，所带电荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动，血清中的γ球蛋白就是如此。对流免疫电泳示意图Ag＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Na+羧基糖-+AbPH=8.6Ag＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Na+羧基糖-+AbPH=8.6主要试剂与器材1.兔抗人免疫血清2.待检人血清3.阴性对照血清4.pH8.6巴比妥缓冲液5.琼脂6.电泳仪7.载玻片、打孔器、微量加样器步骤1.浇板：用5～10ml吸管吸取溶化的15g/l琼脂巴比妥溶液4ml，浇注于洁净载玻片上。2.打孔：待琼脂凝固后，用直径3mm的打孔器成对打孔，孔距为10mm。3.加样：用微量加样器将10μl待检血清加在阴极侧孔内（左侧），诊断血清加到阳极侧孔内（右侧）。然后将琼脂板置于电泳槽中，槽两侧搭用纱布或两层滤纸做盐桥（5×6.5cm）。每端约贴上1cm，其余浸入缓冲液中。4.电泳：接通电源，控制电流强度在2～3mA/cm板宽，电泳2.5h。操作方法1.打孔：用直径3mm的打孔器成对打孔，孔距为8-10mm。（注意：尽量别打裂）2.加样：用微量加样器将10μl（勿溢出）待检血清加在阴极（右侧）侧孔内，兔抗人IgG血清加到阳极（左侧）侧孔内。3.电泳2.5h。8mm+-兔抗人IgG血清待检血清左右结果判断

待检孔与抗血清之间出现沉淀线为阳性，否则为阴性。在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。

免疫电泳免疫电泳凝集反应在颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应的抗体（或抗原），在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应。直接凝集反应试管法凝集试验玻片法凝集试验试管法凝集试验效价：将待检血清进行倍比稀释后，加入等量抗原进行反应。其中能够凝集抗原的最大血清稀释倍数为血清的效价。二、玻片法凝集试验试剂与器材1.人外周血红细胞2.抗－A及抗－B标准血清3.生理盐水4.载玻片、采血针、消毒棉球等操作方法1.取清洁载物玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。于第一格和第二格内各加一滴抗A及抗B标准血清，第三格内滴加一滴生理盐水。2.用无菌采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的三个角分别取血，加入1、2、3格内。3.轻轻摇动玻片，经1～2分钟后用肉眼观察结果，出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀混悬液者为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。间接凝集抑制实验将待检可溶性抗原与标准抗体混合，再加入标准抗原结合的载体微球。待检抗原与标准抗原竞争结合标准抗体，导致凝集现象被抑制。间接凝集抑制实验原理小鼠抗体水平的检测一、免疫血清制备二、血清分离三、酶联免疫吸附试验（ELISE）检测抗体三、腹腔免疫动物：昆明鼠6-8周，雌性抗原：绵羊红细胞（SRBC）腹腔注射：5%的SRBC注射2ml小鼠抓取方法用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部，放在铁笼上，小鼠自然向前挣扎；用另外三个手指压住小鼠的尾巴根部握入手掌；放松拇指和食指，用另外三个手指控制小鼠尾部，然后用食指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠；注意：小鼠尾巴的尾端容易断裂，抓小鼠应抓尾巴中部或根部。小鼠抓取方法腹腔注射左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部，右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺，针头