【生物】基因表达载体的构建课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

学习目标基础目标：说出基因表达载体的组成，分别描述单酶切和双酶切的不同连接方式，比较总结出双酶切的优点；拓展目标：通过课堂当堂练习，掌握双酶切中限制酶的选择原则；挑战目标：结合例题，对于重组DNA分子的筛选方法有初步认识。基因表达载体的构建一

基因表达载体的构建二苏云金杆菌中的Bt基因普通棉花细胞含Bt基因的棉花细胞能产生Bt抗虫蛋白的棉花植株转入植物组织培养技术形成使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。基因工程的核心工作1目的：获取Bt基因后能不能直接将它导入受体细胞呢？一

基因表达载体的构建二2组成：DNA复制的起始位点位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。位于基因的下游；终止转录便于重组DNA分子的筛选和鉴定。构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？拓展延伸诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。环境雌激素（EEs）会影响动物和人类的性腺发育。斑马鱼在EEs的诱导下，会表达出卵黄蛋白原（vtg)。已知绿色荧光蛋白（GFP）基因能使斑马鱼发光，欲获得能检测水中是否含有EEs的转基因斑马鱼，下列操作合理的是（

）A.将EEs基因的启动子与GFP基因重组B.将vtg基因的启动子与GFP基因重组C.将GFP基因的启动子与GFP基因重组D.将GFP基因的启动子与vtg基因重组B①

用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。②

用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③

将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。一

基因表达载体的构建二3构建过程：分析基因表达载体构建的方法任务一（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。请结合下图，回答问题：质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。分析基因表达载体构建的方法任务一（2）用同一种限制酶分别切割质粒和外源DNA构建重组DNA的方法，称为“单酶切法”。如使用限制酶EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，其结果如下：①黏性末端1与2能被DNA连接酶连接吗？黏性末端3与4呢？②黏性末端1与3、2与4能被DNA连接酶连接吗？1与4、2与3呢？分析基因表达载体构建的方法载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接

反向连接341242132134问题：使用同种限制酶进行切割，理论上共有几种连接情况?任务一分析基因表达载体构建的方法任务一请结合下图，回答问题：分析基因表达载体构建的方法任务一（3）用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割质粒和外源DNA构建重组DNA的方法，称为“双酶切法”。如使用限制酶BamHⅠ和HindⅢ分别同时切割质粒和外源DNA，结果如下：①黏性末端1与2能被DNA连接酶连接吗？黏性末端3与4呢？②黏性末端1与3、2与4能被DNA连接酶连接吗？1与4、2与3呢？分析基因表达载体构建的方法任务一（4）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、

外源DNA的优点是什么？双酶切较单酶切有什么好处？①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；②防止目的基因与载体的反向连接。(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是

A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli

DNA

连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用

T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接√课堂练习限制酶的选择任务二(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。限制酶的选择任务二(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则；质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。（2021•辽宁节选）为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入

和

两种不同限制酶的识别序列。课堂练习PvｕⅡ、EcoRⅠ(2023·湖北，4改编)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，

不一定含有目的基因C.若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的培养基中能形成菌落D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet（四环素）的培养基中能形成菌落√课堂练习限制酶的选择任务二(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则；若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。如图所示的质粒中，Tetr为四环素抗性基因，LacZ′基因的表达产物能使白色的大肠杆菌菌落变成蓝色。现用EcoRⅠ切割目的基因及质粒载体并进行连接，将得到的重组质粒转化大肠杆菌，以对目的基因进行保存和扩增。请回答下列问题：(2)标记四环素白色(3)启动子终止子目的基因与质粒载体反向连接两种限制酶(2)LacZ′基因在基因工程中起__________基因的作用。为筛选导入重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中加入___________，筛选________(填“蓝色”或“白色”)菌落。(3)若需要将这个质粒改造成基因工程表达载体，还需要插入________和________部分。将改造后的表达载体和目的基因经EcoRⅠ酶切连接，并成功导入受体细胞后，发现仍有部分细胞不能表达出目的蛋白，最可能的原因是_______________________________。为了避免上述情况发生，最好用________________切割目的基因和表达载体。课堂练习限制酶的选择任务二(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。若要利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA(图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列正确的是()A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体课堂练习限制酶的选择任务二(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。课堂小结限制酶的选择(1)不破坏目的基因原则；(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，提高筛选成功率。(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载