马铃署脱毒种署生产-茎尖脱毒

马铃薯脱毒种薯生产

—茎尖脱毒

主讲人：姜放军湖南生物机电职业技术学院植物组织培养技术

解剖镜下剥取茎尖并培养任务1茎尖初代培养和继代培养

任务2脱毒苗鉴定，确定核心种苗

任务3无病毒苗快速繁殖培养

任务4诱导试管薯

任务5试管苗扦插生产微型薯

任务6脱毒马铃薯原种生产

任务7工作任务材料选择和消毒茎尖剥离和接种初代培养继代增殖生产脱毒原种

茎尖脱毒技术诱导试管薯、微型薯脱毒苗的鉴定操作流程（一）材料选择和消毒选择：注意品种的典型性，选取病症最轻的接近健康的植株。直接切取植株的分枝顶芽和腋芽剥离培养。切取4-6cm长的顶芽或侧芽，除去外部可见的小叶。消毒：先用自来水冲洗1h左右，再用70%酒精处理30s，然后用10%漂白粉溶液浸泡5-10min，最后用无菌水冲洗2-3次即可。（二）茎尖剥离和接种

将消毒后的材料在10-40倍的双筒解剖镜下，用解剖镜剥取外部幼叶赫大的叶原基，直接露出圆点是生长点，再用解剖刀切取0.1-0.3mm，带有1-2个叶原基，并迅速接种到诱导培养基上。解剖时注意：使茎尖迅速变干，在材料下垫上一块湿润的无菌纸也可达到保持茎尖新鲜的目的。另外：茎尖脱毒效果与切取的茎尖大小直接相关，茎尖脱毒效果越好，但茎尖越小再生植株的形成也越困难。解剖镜下剥取茎尖

以马铃薯试管苗或微型薯的萌芽为材料，在双筒解剖镜下剥0.2-0.5mm带1-2个叶原基的茎尖培养在诱导培养基上。诱导培养基配方：MS+GA30.2

+NAA0.05+6-BA0.5+肌醇100g/L+2%蔗糖+0.6%琼脂培养条件：25℃，2000Lx，10h/d，3-6个月。（三）茎尖初代培养

备用苗在培养的茎尖中选取转绿的茎尖转接到增殖培养基上作为病毒待检材料备用。（四）脱毒苗鉴定，确定核心种苗

病毒鉴定的常用方法有目测法、指示植物鉴定法和血清法。目测法：根据脱毒苗和带毒苗在形态、长势上差异来鉴定。脱毒苗生长快，叶色浓，叶平展，植株健壮。带毒苗长势弱、叶色淡，叶片出现花叶和褪绿斑。在培养过程中应时常观察，及时将带病毒症状明显的试管苗去除。

指示植物法：常用的马铃薯病毒鉴定指示植物有苋科植物千日红和藜属植物苋色藜。方法：

1、取被鉴定植株幼叶1～3g，置于等容积（W/V）的缓冲液（0.1mol/L磷酸钠）中研成匀浆，再在汁液中加入少许600号金刚砂，作为指示植物摩擦剂，使叶片造成小的伤口，又不破坏表皮细胞。2、然后用棉球沾取汁液在指示叶面上轻轻涂抹几次进行接种。把接种后的植物放在温室或者防虫网内，保温15～25℃，株间与其他植物间都要留一定距离。3、症状的表现取决于病毒性质和汁液中病毒的数量，一般需要6～8d或是几周，指示植物即可表现症状。4、凡是出现枯斑、花叶等病毒症状的茎尖苗为带毒苗，将相应的试管苗淘汰。

采用酶联血清免疫吸附反应(ELISA）鉴定由茎尖培养获得的试管苗是否带有马铃薯主要病毒。确定无毒核心种苗。经鉴定脱毒的马铃薯试管苗，采用固体、液体培养基相结合方法扩繁，要求切段为1-2片叶的茎段，繁殖系数达到1：3，25d继代一次。（五）脱毒苗继代增殖

诱导试管薯将健壮的试管苗转到含8%糖浓度的MS培养基上，18-20℃，光照8h/d黑暗条件下培养，诱导试管薯，要求每株诱导1.5粒，每瓶达到10粒以上，每粒不小于0.5g。（六）诱导试管薯、微型薯

用蛭石和珍珠岩按1：0.5的比例准备扦插床，高密度扦插试管苗（10*5cm），业余时间进行温度、湿度控制、培埋蛭石等管理，平均每株生产微型薯1.2粒，每粒2g以上。试管苗扦插生产微型薯

播种微型薯生