葡萄组织培养技术-项目介绍

菊花的组织培养与快繁技术

主讲人：姜放军湖南生物机电职业技术学院植物组织培养技术教学终极目标能选取菊花外植体进行菊花的组织培养与快速繁殖能解决菊花组培快繁中出现的基本问题。熟悉菊花的组培脱毒方法和流程。熟悉常用脱毒苗检测方法。促成目标教学目标菊花是菊科菊属的多年生宿根草本植物,是我国的传统名花和世界四大切花之一长期以来菊花采用分株、扦插等无性繁殖方法进行繁殖,但是传统的繁殖方法易受环境影响,繁殖周期长,随着市场需求的急剧增加,已经不能满足市场日益发展的需要。植物组织培养具有增殖效率高、繁殖速度快的特点,可以用较短的时间和较少的空间生产出大量的试管苗项目介绍矮缩类病毒褪绿斑驳病毒B病毒菊花番茄不孕病毒病毒种类工作任务

通过菊花的茎尖培养获得无病植株任务1通过愈伤组织途径或丛芽途径获得菊花试管苗任务2菊花试管苗生根培养

任务3实践操作一、菊花的茎尖组织培养脱毒（一）材料选择和消毒（二）脱毒苗培养（三）脱毒鉴定（四）移栽二、菊花的组培快繁（一）外植体材料选择与灭菌（二）诱导、继代培养（三）生根、移栽茎尖培养脱毒菊花脱毒苗外植体愈伤组织诱芽生根丛生芽成苗脱毒苗鉴定菊花脱毒流程图（一）材料选择和消毒

在温室中选取生长健壮的菊花，剪下其茎尖段，放入无菌容器内封口。用清水反复冲洗4～5次，将洗净的材料放到75%的酒精溶液中浸泡30s。然后用蒸馏水洗净，再将材料放入10%的漂白粉滤液消毒8min，再用无菌水冲洗3～5次，滤纸吸干。再将材料转入0.1%升汞溶液消毒，不低于5min，最后用无菌水冲洗3～5次，滤纸吸干。最后将材料放入无菌的三角瓶中封口待用。菊花的茎尖组织培养脱毒（二）脱毒苗培养

在超净工作台上将灭过菌的材料放入无菌培养皿中，用解剖针剥去可见的生长点，周围可见的小叶在解剖镜下只剩下1～2个叶原基，取下只有0.2～0.3mm生长点，放入提前做好的培养基中培养。

然后将装有材料的培养基放入光照箱中进行培养。要求在黑暗或散射光下培养，温度28℃。待培养外植体出现愈伤组织后更换培养基，对其进行继代培养。并在光照灯下补充光照，光照强度1000～4000Lx，温度23～25℃。待出芽后将其转入到另外的生根培养基中促使生根。（三）脱毒鉴定

采用病毒的汁液感染法，由受检植株上取下叶片，置于等容积(W/V)的缓冲液(0.1mol/L磷酸钠)中，用研钵体和研杆将叶片研碎。在指示植物(一般采用万寿菊)的叶片上滴上此溶液，观察1周后得到结果。并统计脱毒率。待测（四）移栽

幼苗移栽前先炼苗2～3d，即移栽前先把培养基瓶的塞子打开，放在25℃左右的温室中，增加组培苗对外界环境的适应能力。移栽时仔细洗去附着在幼苗上的培养基，然后移植于适宜的基质中，浇足定根水，盖上薄膜保持温度，避免阳光直射，并注意通风换气，温度控制在18～20℃。1～2周后揭掉薄膜，每隔3～5d叶面喷施营养液，1个月即可上盆或定植于田间。菊花的组培快繁（一）外植体材料选择与灭菌

选取在脱毒实验中成功移栽上盆而且长势健壮的植株作为外植体母株，以培养出大量的无病植株。在外植体的选择上，可以选取生长健壮嫩茎和叶片作为材料。流水洗去表面灰尘，在超净工作台用75%酒精处理20～30s，再用无菌水冲洗3～5次，转入0.1%升汞溶液浸泡7～10min，再用无菌水冲洗4～6次，用滤纸吸干水分。（二）诱导、继代培养

在无菌条件下，用剪刀将外植体茎段切成0.5～1cm长小段，水平放置接种；叶片切成5mm×5mm小块，下表皮朝下水平放置接入初代培养基中，接种完成后即转入培养室进行初代培养，培养温度22～28℃，光强1000～4000Lx。1.间接再生途径

茎段和叶片接种到培养基上，均可以从一周内，明显可以看到茎段和叶片开始膨大。20d后产生愈伤组织，30d愈伤组织分化出芽。2.直接再生途径

茎段和叶片接种到培养基上，均可以从一周内，明显可以看到茎段和叶片开始膨大。但是20d后不产生愈伤组织，直接分化出芽。菊花再生植株（三）生根、移栽

当培养基中的植株出芽后，再将其转入到生根培养基中，诱导其生根。或通过无根嫩茎扦插生根。1.试管生根

切取3cm左右无根嫩茎，转插到1/2MS+NAA0.1培养基中，经两周即可生根，然后移栽驯化。移栽初期保持高湿度条件，营养钵基质浇透水，取出生根的试管苗，洗掉附加在根部的培养基，用竹签在基质上打一小孔，将幼苗插入基质中。然后家设小拱棚以保湿，随着幼苗的生长，逐渐降低空气湿度和基质含水量，转为正常的管理阶段。2.扦插生根

利用菊花无根嫩茎易于生根的特点，也可免去试管生根这道程序。剪取2～3cm无根苗，插植到珍珠岩或蛭石的基质中，基质事先用生根激素溶液浸透，10d后生根率可达95%～100%。菊花炼苗菊花移栽苗如何检测脱毒苗脱毒率（效果）？一、直接检测法

看植株的茎叶是否有该病毒所有的可见症状侵染后的病株表现为局部或系统花叶、皱缩、卷叶、黄化，老叶上出现紫色边缘的褪绿斑，也有沿叶脉形成紫色羽状班驳的，在春秋季比较明显。病株较脱毒苗生长势减弱，有矮化或畸形等症状。问题探究一草莓无病毒苗草莓有病毒苗（二）生物鉴定法1.敏感（指示）植物的概念

有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上表现特殊的病斑，这种植物称为敏感植物或指示植物。每种病毒都有自己的敏感植物，如马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、新叶烟，毛叶曼佗罗；草莓病毒的敏感植物有野草莓、野红草莓；香石竹病毒的指示植物昆落阿藜、苋色藜；菊花病毒的敏感植物有矮牵牛、缸豆。2.鉴定方法（1）摩擦接种鉴定法取待检测植物的汁液摩擦接种在各自的敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否脱除了病毒。（2）嫁接鉴定法

有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门介体如蚜虫传播，放蚜虫咬待测植株，再将蚜虫接种到敏感植物上，一段时间后观察敏感植物症状，根据敏感植物的病症表现来判断是否脱除了病毒。优点：条件简单，操作方便。缺点：只能测出病毒的相对感染力，并且只能用来鉴定靠汁液及嫁接传染的病毒。（三）抗血清鉴定法

当动物被病毒或人工注射异体蛋白质时，在动物体内会产生特异的免疫球蛋白，其被称为“抗体”，而引起形成抗体的物质（病毒或异体蛋白）称为“抗原”。

抗体在特殊的细胞内产生，进入血液存在于血清和体液内。抗原和抗体结合的反应称为“血清反应”，抗原和抗体结合表现出很强的特异性，即一种病毒产生的抗体只能结合该种病毒，因此用已知病毒的抗血清可以来鉴定未知病毒的种类。

这种方法灵敏度高，特异性强，是近年来抗血清鉴定方法中发展最迅速，应最广泛的技术。

酶联免疫吸附反应法是一种普遍采用的抗血清鉴定方法，该方法将抗原固定在酶标记板上，加入待测血清，然后在加入酶标记的抗体（酶通常是一种过氧化酶或磷酸酶），使与待测血清中已与抗原结合的特异性抗体结合，最后用分光光度计做出判断。酶联免疫吸附法是一种非常敏感的方法，能检测出10-5数量级的病毒浓度。（四）分光光度法

要定量测定病毒，可以采用分光光度法。即把病毒的纯品干燥、称重，配成已知浓度的病毒悬浮液，在260nm下测其光密度，并折算成消光系数（E10.1%cm）。一般常见病毒的消光系数都可以从文献中查出来。利用分光光度法测得的病毒浓度是指全部核蛋白的浓度。（五）电子显微镜鉴定法

用电镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有病毒粒子存在，还可以测量病毒颗粒的大小、形状和结构。电镜鉴定法是一种即准确又科学的鉴定方法。

人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒；普通光学显微镜只能看到小至200bm的微粒；电子显微镜能分辨0.5μm大小的病毒颗粒。优点：灵敏度高。是一种较为先进的方法缺点：需一定的设备和技术HIVSARS问题探究二

如何建立植物再生体系？

建立再生体系，有直接和间接再生途径。先在培养基上诱导外植体产生愈伤组织，再使外植体经过脱分化和再分化诱导芽，这称为间接再生途径。

特点：操作繁琐、成本较高。

通过最初的愈伤组织阶段进一步诱导芽可能会导致营养繁殖变异和嵌合体的产生，而直接再生不定芽，称为直接再生途径。特点：直接再生途径不需要设置专门诱导愈伤组织的培养基，直接诱导出芽，简化了培养程序，节省了时间和组培费用。知识拓展菊花花瓣组织培养技术

（一）外植体的选择和消毒

将菊花的花瓣用自来水冲洗20min,用70%的酒精浸泡30s,再用0.1%的升汞分别消毒10min,无菌水冲洗4～5次,用无菌滤纸吸干水分。（二）初代培养

在无菌条件下将花瓣切成5mm×5mm小块,接种到MS+6-BA1.5+NAA0.1的诱导培养基上。培养条件:培养温度为(25±2)℃,光照强度2000Lx,光照时间为12h/d,空气相对湿度为65%左右。培养基pH值为5.8～6.0。培养25d后出现黄绿色的愈伤组织块，诱导率高