木瓜蛋白酶提取实验方案

木瓜蛋白酶提取实验方案实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papayaproteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapainM），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐析时溶液PH在木瓜蛋白酶等电点时（PI=8.75）则效果最好，盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。木瓜蛋白酶活力测定：蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯乙酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液（编号为酶液1）。4.2.2粗酶液纯化：将粗液放入冰桶中，加入适量酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.004mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。酶液+保护剂（ml）硫酸铵粉末（至终浓度20%）（g）硫酸铵粉末（至终浓度的40%）（g）酶液+保护剂（ml）冷无水乙醇（65%）（ml）酶原液370+10148.6调节ph为6.0，4℃静置过夜酶原液470+10置于冰桶中20静置30min，离心4000r/min，30min，弃沉淀22静置30min，离心4000r/min，30min，取沉淀，加10ml蒸馏水取1ml酶液（酶液2），-20℃保存9+118.6对过夜的酶液继续处理酶液+保护剂（ml）硫酸铵粉末（至终浓度20%）（g）硫酸铵粉末（至终浓度40%）（ml）酶原液34℃静置过夜4000r/mn离心30mn,取沉淀，分别加加10ml蒸馏水取1ml酶液（酶液3），-20℃保存9+1置冰桶中2.5静置30min,离心4000r/min,30min，弃沉淀2.7静置30min,离心4000r/min,30min，取沉淀，加入10ml蒸馏水取1ml酶液（酶液4），-20℃保存透析袋处理取酶液并编号酶液6，-20℃保存酶原液4编号酶液5，-20℃保存透析袋处理取酶液并编号酶液7，-20℃保存4.2.3透析：8000-14000标号的透析袋处理：①取透析袋剪成适当长度的小段。放入大体积的2%(m/v)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。②用蒸馏水彻底漂洗透析袋。放在1mmol/LEDTA(pH8.0)中将之煮沸10分钟。③冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套，在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。④系好透析袋的一端，从另一端注入酶液4、5，将透析袋放入蒸馏水中，在摇床上震荡，时时换蒸馏水。⑤直至向蒸馏水中加入氯化钡溶液，无沉淀产生及透析除盐完成。取出蛋白质溶液。60%乙醇60%乙醇透析膜处理40%硫酸铵45%饱和硫酸铵60%乙醇酶液1酶液3酶液4酶液2酶液5酶液6酶液7番木瓜透析膜处理4.3木瓜蛋白酶活性及总蛋白含量测定：4.3.1酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL。（此为50ug/ml的标准液）酶液的处理：取0.3ml酶液，加酶稀释液2.7ml，稀释至3mL。操作待测液：准确量取酶液溶液各1.0mL，分别置于2支10mL带塞试管中，于50度水浴预热5分钟，准确加入50度预热的酪蛋白溶液5mL，立即振摇，置50度水浴中，精确反应10min后，加三氯乙酸溶液5.0mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A。空白对照液：再精确量取酶液1.0mL，置于10mL具塞试管中，于50度水浴预热5min，准确加入50度预热的蒸馏水5ml,置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A0。酪氨酸标准液：另取酪氨酸对照溶液，以蒸馏水为空白，在275nm的波长处测定吸光度An。酶活力单位定义为在测定条件下,每1min生成1μg/mL酪氨酸所需的酶量。公式：酶活力（U/g）=式中:Ｗ1—酪氨酸标准液每1ｍＬ中含酪氨酸的量,单位为微克(μｇ);10—反应时间;11—测定总体积;n—待测液的稀释倍数;1000—毫克与克的转换倍数。在上述条件下,每分钟水解酪蛋白生成1μｇ酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位。4.3.2酶含量的测量：取8支15mL试管，按下表加入试剂管号12345678蛋白质标准溶液（ml）00.10.20.30.40.60.81.O蒸馏水（ml）1.00.90.80.70.60.40.20考马斯亮蓝（ml）4.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白质含量（ug）0102030406080100A595将试管摇匀，放置2-3分钟。用分光光度计比色测定吸光值A595nm。(注意应在1小时内完成比色)，以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。对酶液进行稀释，统一酶液体积至100ml：分别取1ml