QuEChERS 提取联合超高效液相色谱-串联质谱仪可同时检测畜禽粪便中11种大环内酯类药物残留方法简便快捷高效

摘要［目的］建立1种应用超高效液相色谱-串联质谱仪同时检测畜禽粪便中11种大环内酯类药物的方法，为后期畜禽粪便的再利用提供技术支持。［方法］以乙腈提取，QuEChERS净化，采用乙腈+含0.1%甲酸的5mmol/kg乙酸铵水溶液作为流动相，HPLC-MS/MS确证检测，外标法定量，考察不同前处理条件和仪器条件对检测结果的影响，并检测鸡、猪不同时期排泄的粪便中竹桃霉素、螺旋霉素等11种大环内酯类药物含量。［结果］定量限为0.0050～0.0100μg/kg，回收率为80.2%～101.2%，相对标准偏差为0.8%～6.2%；不同种类大环内酯在畜禽粪便中的代谢速率也相差较大。［结论］与传统检测方法相比，该方法具有定量限低、稳定性好、简便快捷等优势。1背景随着规模化、集成化现代养殖业的飞速发展，作为广谱抑菌剂的大环内酯类药物，也被广泛应用于畜禽动物养殖中。动物通过食物和其他方法获得的药物不能被身体完全吸收，30%～90%未被吸收的药物会随粪便一起排出体外，导致抗生素在畜禽粪便中残留。据统计，目前我国年产畜禽粪污已超过240亿t，而畜禽粪便中没有被动物完全吸收的营养成分也会随粪便排出，故为了提高养殖利益，畜禽粪便就被加工成有机肥料还田，畜牧粪便如猪粪也会加工成家禽饲料，或者用于沼气发电等。但畜禽粪便中含有的抗生素类药物因其仍有活性，并不会停止代谢，其最终的代谢产物会随着其产品如肥料和饲料等再次进入环境以及动植物体内，从而给人体带来直接或间接的危害。因此，建立1种准确度高、方便快捷并能够检测大环内酯类药物在畜禽粪便中代谢情况的方法十分必要。针对畜禽粪便中大环内酯类的药物残留，不同学者也有不同的研究。现行国家标准中大环内酯类化合物的检测方法中GB31660.1—2019，利用液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中9种大环内酯，其检出限均为1.0μg/kg；SN/T1777.2—2007，利用高效液相色谱串联质谱法同时测定动物源性产品中7种大环内酯，其检出限均为20μg/kg；GB/T35951—2018，利用高效液相色谱串联质谱法同时测定化妆品中8种大环内酯，其检出限为0.01～0.75μg/kg。黄小龙等通过HLB固相萃取柱净化，建立了可食动物肌肉中竹桃霉素、克林霉素、交沙霉素3种大环内酯类残留的检测，检出限为0.48～0.72μg/kg。本文以畜禽粪便为检测样本，应用简便快捷的QuEChERS提取技术和灵敏度较高的超高效液相色谱－串联质谱仪建立了1种同时检测畜禽粪便中11种大环内酯类药物的方法，并应用该方法对用药后1d的鸡和猪的粪便进行检测，并将相同的样品在第3天、第7天进行检测，从而研究粪便中大环内酯的代谢速率，为畜禽粪便后期利用提供技术支持。2结果与分析2.1色谱条件的优化1）流动相的选择优化。对比了有机相（甲醇和乙腈），水相（水、5mmol/kg乙酸铵、0.1%甲酸、含0.1%甲酸的5mmol/kg乙酸铵水溶液）的不同组合对11种大环内酯的分离度的影响，结果表明：乙腈+含0.1%甲酸的5mmol/kg乙酸铵水溶液作为流动相时，11种大环内酯经梯度洗涤完全分离且具有更好的峰值形状和更高的灵敏度。因此，本研究选择乙腈+水作为流动相，此流动相条件下11种大环内酯药物的保留时间和总离子流图如图1所示。图1大环内酯类药物的保留时间和总离子流图2）质谱条件的优化。首先，对质量浓度为0.1μg/mL的11种大环内酯类药物的单标标准液进行全扫描，根据峰高、峰形以及信噪比等因素确定母离子、定性离子和定量离子，然后在质谱多反应检测（MRM）模式下，对Q1PreBias（Q1）、Q3PreBias（Q3）和碰撞电压（CE）进行参数优化，最终确定质谱参数，如表1所示。表1大环内酯类化合物的质谱参数注：“*”为定量离子。2.2前处理条件的优化1）提取溶剂的选择。本研究分别比较不同有机试剂乙腈、甲醇、正己烷、丙酮以及乙腈饱和的正己烷溶液作为提取溶剂时11种大环内酯的回收率。试验结果表明，当乙腈作为提取液时，11种目标大环内酯类药物的回收率为64.8%～90.2%，优于其他提取溶剂的提取效果。因此，本研究采用乙腈作为提取溶剂（表2）。表2不同提取液条件下11种大环内酯的回收率%2）净化方法的选择。本研究采用QuEChERS净化方法，着重考察了不同用量的Carb和C18对回收率的影响。经正交试验结果表明，当Carb和C18的使用量均为0.50g时回收率最高。3）基质效应（ME）。为了确保定量结果的准确性，基质效应是需要考察的第一要素。图2列出了11种大环内酯在鸡粪便中的基质效应。结果表明，这11种大环内酯存在明显的基质效应，其中红霉素、泰乐菌素等具有基质减弱效应，交沙霉素、林可霉素等存在基质增强效应。因此，本研究采用空白基质加标曲线来校正，以克服基质效应。图211种大环内酯的基质效应2.3方法学验证将空白基质按相关方法处理，绘制基质加标曲线。以被测组分的浓度为横坐标，被测组分的峰面积与内标峰面积比值为纵坐标拟合工作曲线，得到相关系数。根据定量限不同，分别添加定量限的1、2、10倍制成模拟加标样品，测定11种大环内酯的回收率及变异系数，11种大环内酯的线性范围及回收率结果见表3。由表3可知，11种大环内酯的相关系数均高于0.9945，回收率为80.2%～101.2%，相对标准偏差为0.8%～6.2%，方法检出限为0.0015～0.0030μg/kg，定量限为0.0050～0.0100μg/kg。表311种大环内酯的线性范围、相关系数、检出限、定量限、回收率、相对标准偏差注：“ND”表示未检出，下同。2.4大环内酯类药物代谢分析应用本方法分别对用药后第1天的粪便进行采集，然后在第3天、第7天分别采集相同的粪便，并进行11种大环内酯类药物含量的检测，检测结果见表4。不同种类大环内酯的化学性质不尽相同，在畜禽粪便中的代谢速率也相差较大。有些大环内酯类药物可以在1～3d内完全代谢完毕，如竹桃霉素；有些大环内酯类药物的代谢周期可达1周以上，如红霉素。因此，不同种类的大环内脂在畜禽粪便中的代谢时长不同，这为畜禽粪便的安全利用提供了数据支撑。表411种大环内酯类药物含量检测结果μg/kg3结论本文建立了在畜禽粪便中同时测定11种大环内酯类药物的超高效液相色谱－串联质谱的测定