免疫组织化学染色注意事项

免疫组织化学染色注意事项

李磊抗体的保存浓缩抗体，在有效期以内，一般只需放在普通4℃冰箱内保存，保存时间可达5-10年以上（免疫荧光试剂例外）。最好不要用塑料管分装，因为塑料对抗体有吸附作用，用负20℃至负40℃低温冰箱冷冻，由于冻融也会使抗体效价降低。而即用型抗体保存时间一般在一年以内。用PBS稀释的抗体，一般可放置1个月，稀释比越低，效价降低越快。非特异性找色的原因1、抗体稀释度过高，导致切片深染。现象：无法分清细胞找色解决办法：找出最佳的稀释比阳性对照染色正常，受测组织染色阴性一、抗原修复不当。二、一抗与二抗检测系统匹配错误三、实验操作错误四、使用不合格的稀释剂五、一抗选择错误。六、一抗二抗检测系统、显色试剂被污染，失效或已超过有效期。七、二抗检测系统与显色试剂不匹配八、抗原含量过低九、试剂浓度过低，过高或不合适的孵育时间和温度。阳性对照正常，受测组织染色弱一、固定液使用不当，破坏了组织的抗原二、组织经固定和包埋后抗原被破坏。三、烤片温度过高或时间过长。阳性对照和受测组织均为染色弱一、抗原修复方式不正确或遗漏，或者是修复时间、温度、修复液的PH值没有达到要求。二、过氧化物酶阻断试剂阻断或血清封闭时间过长，试剂浓度不合适。三、一抗，二抗检测系统、显色试剂浓度过高、过低或孵育时间过短。四、使用已超过有效期的试剂。五、孵育温度过低。六、滴加试剂时，组织上的缓冲液（或血清）残留过多，导致试剂滴加后被稀释。七、复染液复染过度。八、重复使用抗原修复液。九、显色试剂孵育时间过短或试剂配制错误。对照组织和受测组织，或在一些组织成分如脂肪、结缔组织和上皮组织中有背景染色。一、抗原修复过度二、一抗浓度过高，孵育时间过长，或孵育温度过高。三、二抗检测系统浓度过高，孵育时间过长或孵育温度过高。四、显色试剂孵育时间过长。五、PBS缓冲液重复使用多次或冲洗不足。六、使用错误的封闭血清。七、切片粘附剂过厚。受测组织和阴性对照玻片有背景染色，而阳性和阴性组织对照染色正常。一、组织固定不及时，造成部分抗原弥散并遗留在组织内。二、取材时，由于使用钝的刀片，导致组织受到人为挤压而变形，血清蛋白弥散并遗留在组织内。三、受测组织有部分坏死、损伤或压迫成分。四、组织切片太厚。阴性试剂对照有背景染色，而阳性、阴性组织对照和受测组织染色正常。一、阴性对照血清浓度不合适。二、阴性对照血清被污染并与受测组织中的蛋白发生交叉反应。2、抗体不纯或抗体特异性不强，交叉反应较多，或抗体表达较弱现象：阳性细胞和阴性细胞都着色，只是阳性细胞着色略强一些。像这类情况很难有好的办法解决，可找一个背景着色较浅的试剂盒试一下，或用其它修复方法试试。组织染色灶状背景染色一、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，实验过程中滴加试剂后不易冲洗干净，导致染色过深。二、用于裱片的水浴锅中的水质被细菌或酵母菌等污染。三、制作涂胶玻片时，浓度过高，干燥后在玻片留下白色小点，显色时白色小点着色。色原颗粒未完全溶解。切片出现边缘效应一、组织边缘与玻片黏贴不牢，经抗原热修复或后续缓冲液冲洗后，造成边缘组织松脱浮在玻片上方，每次冲洗时不易将组织下面的试剂洗干净，导致此区域染色过深。二、滴加试剂时，试剂未充分覆盖组织，导致组织边缘无试剂或试剂很少，孵育时此区域容易首先变干，造成浓度较中心组织高而导致染色过深。切片出现“阴阳脸”着色一、滴加试剂时，试剂未完全覆盖组织。二、试验操作台不平或孵育盒不平，导致切片有个倾斜度最终导致“阴阳脸”结果。三、滴加试剂到组织上时存在气泡，却没有将气泡除去。四、组织固定时间过短，造成中心部位固定不足。切片出现非特异的细胞核着色组织前期处理不适当，如组织在二甲苯中浸泡时间过长，固定液使用不当，组织变干，抗原修复液的PH值和修复时间不当或修复过程中修复液蒸发过多，造成最后部分组织没有浸泡在修复液中。使用生物素二抗检测系统时，组织中内源性生物素显色这种非特异性显色通常发生在高代谢器官组织中，当组织切片进行抗原修复后，组织中所含的内源性生物素同生物素二抗检测系统中的链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶发生链接二造成非特异性显色，显色多位于胞浆中，且迷惑性极大。使用辣根过氧化物酶二抗检测系统时，组织中内源性过氧化物酶显色这种显色通常发生在红细胞，坏死组织，炎症细胞中，是由于组织中所含的过氧化物没有用相应的阻断试剂阻断或阻断不完全。3、抗体本身的特异性异常表达从理论上说一种